许中衎 , 王黎霞 , 王 静 , 李 畅 , 乔尚怡 , 张榕珍 ,张一弛 , 芳 卉 , 张建军 , 安 健

(1.北京农学院动物科学技术学院 国家级动物类实验教学示范中心，北京昌平102206 ；2.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京房山102442)

鸡球虫病是由艾美耳属的单种或多种鸡球虫引起的主要侵袭鸡肠道的全球性寄生虫病，是我国严重危害养禽业的常见疾病之一。经统计，全球养禽业每年因球虫感染造成的经济损失高达20亿美元之多[1]。

迄今为止，防治鸡球虫病仍以药物治疗为主，但随着时间的积累，球虫表现出的耐药性也逐步增强，而药物残留所带来的危害也开始引起人们的关注，这使得越来越多的研究人员将目光由控制、治疗球虫病转向免疫预防这条途径[2]，研发新型疫苗成为预防鸡球虫病的主要发展方向。顶复门原生寄生虫入侵宿主细胞的过程包括粘附、侵入、形成纳虫空泡、寄生[3]。而参与以上过程的相关蛋白分子是众多重要的鸡球虫抗原，如棒状体、微线体等蛋白，这些鸡球虫抗原都或许可作为研制鸡球虫病新型疫苗的候选因子[4-6]。本试验通过将E.tenella第二代裂殖子和MDBK细胞进行无血清间接共培养，获得了主要E.tenella多种外分泌性蛋白，接着对这些蛋白的理化性质、信号肽等进行预测分析，预测其作为疫苗候选抗原的可能性。本次试验为分泌性蛋白的生物学功能研究奠定基础，也为今后鸡球虫病疫苗的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株E.tenellaB4株，由北京农学院病理实验室提供，分离自昌平某鸡场，复壮周期为3个月。

1.1.2 细胞 MDBK细胞，本实验室保存用于鸡球虫研究的贴壁细胞系。

1.1.3 试验动物 1日龄农大3号公鸡雏，将其饲喂于无球虫及其他病原环境中，使用不含抗球虫药的雏鸡饲料，饲喂至14日龄，期间自由采食。

1.1.4 主要试剂 TRIzol,购自美国Ambion公司；DNA Marker,购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，购自美国TaKaRa公司；2×TaqDNA聚合酶,购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶EcoR I/NotI、DNA连接酶，购自美国NEB公司；E.coliDH5α感受态细胞,购自北京中美泰和生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1E.tenella第二代裂殖子的收集 取柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊按7×104/只接种7日龄无球虫鸡；112 h后剖杀取盲肠，浸于洗脱液内，剪开盲肠，洗去盲肠内容物；将剪开的盲肠置于冰上，于洗脱液中刮下肠黏膜，统一收集以上洗脱液后匀浆，使裂殖子游离出来；200目和100目网筛过滤匀浆；将所得滤液1 500 r/min离心10 min，弃去上清，洗脱液重悬沉淀；600 r/min离心8 min，收集上清(因慢速离心下，质量较大的红细胞和杂质会沉下，裂殖子会悬浮于上清液中，故收集上清)。上清经1 500 r/min离心10 min，取沉淀；适量洗脱液重悬沉淀，置于42 ℃水浴中。装柱：将配置好的DE-52纤维素(配制方法略)装入直径1 cm，高约30 cm的层析柱中至柱高4～5 cm。将裂殖子重悬液加入层析柱中，收集纯化后的裂殖子。

1.2.2E.tenella与MDBK细胞的间接共培养 计数纯化后的裂殖子1 200万个/孔， 置于42 ℃中保持活性，准备好共培养；待MDBK细胞长至80%铺满瓶底后，进行细胞换液，将完全培养液换成无血清无双抗的DMEM；放入Transwell；将含有裂殖子的洗脱液置于Transwell小室中，隔离共培养12 h，共重复3孔；取3孔上清液置于10 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白质定性分析。

1.2.3 液相色谱-串联质谱分析 将样品(上清液)用蛋白酶降解，使得长链的蛋白质剪切成短链的肽段；酶解后的蛋白片段通过质谱测定，选择出离子丰度较高的肽段进一步破碎得到各种碎片离子，再通过Mascot检索软件，与蛋白质数据库相对比进行蛋白鉴定，确定蛋白。

1.2.4 生物信息学分析 运用SOPMA、TMHMM、Protscale、SignalP、抗原表位预测软件和Phyre2.0等生物信息学软件预测这些蛋白质的理化性质、二级结构、疏水性、信号肽、抗原表位和三维结构等，预测其作为疫苗候选抗原的可能性。

2 结果

2.1E.tenella外分泌性蛋白的LC-MS/MS检测 将液相色谱-串联质谱检测到的蛋白数据连接Mascot检索软件，图1是Mascot检索软件打分结果，横坐标指匹配的蛋白得分，纵坐标指匹配的蛋白数目，柱是指匹配的结果，阴影内(蛋白得分<33)表示小于阈值分数的不可信结果，即打分大于33分的蛋白99%以上为该蛋白。得分前4位蛋白如表1所示。

图1 LC-MS/MS检测结果

表1 LC-MS/MS检测结果

2.2E.tenella外分泌性蛋白的生物信息学分析 利用SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr)预测以上所得到的4种蛋白的二级结构得知，Hsp90中参与α-螺旋形成的氨基酸占50.98%，参与β-转角形成的氨基酸占5.90%，参与延伸链形成的氨基酸占14.61%，参与无规则卷曲形成的氨基酸占28.51%；Histone 4中参与α-螺旋形成的氨基酸占46.60%，参与β-转角形成的氨基酸占11.65%，参与延伸链形成的氨基酸占14.56%，参与无规则卷曲形成的氨基酸占27.18%；HP中参与α-螺旋形成的氨基酸占63.09%，参与β-转角形成的氨基酸占8.72%，参与延伸链形成的氨基酸占3.36%，参与无规则卷曲形成的氨基酸占24.83%；Ribosomal protein中参与α-螺旋形成的氨基酸占23.26%，参与β-转角形成的氨基酸占9.30%，参与延伸链形成的氨基酸占18.6%，参与无规则卷曲形成的氨基酸占48.84%。此外发现，4个蛋白均无β-折叠结构(如表2)。

表2 外分泌性蛋白的二级结构预测

利用TMHMM在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对以上所得4种蛋白的跨膜结构域进行分析，结果发现Hsp90(见中插彩版图2左上)，Histone 4(见中插彩版图2右上)，HP(见中插彩版图2左下)和Ribosomal protein(见中插彩版图2右下)的膜内区域几率均极低，说明这4种蛋白均无跨膜区。

图2 外分泌性蛋白的跨膜结构域分析

利用Protscale在线软件(https://web.expasy.org/protscale/)分析以上所得4种蛋白的疏水性质，结果发现Hsp90(图3左上)多肽链，Histone 4(图3右上)多肽链，HP(图3左下)多肽链和Ribosomal protein(图3右下)多肽链均具有极强的疏水性。

图3 外分泌性蛋白的疏水性分析

利用SignalP在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对以上所得4种蛋白的信号肽进行分析，结果分别得到：Hsp90(见中插彩版图4左上)的C=0.139，S=0.788，Y=0.289，D=0.494，在第16和17位氨基酸之间有剪切位点的可能性较大，推断Hsp90存在信号肽；Histone 4(见中插彩版图4右上)的C=0.170，S=0.682，Y=0.313，D=0.459，在第17和18位氨基酸之间有剪切位点的可能性较大，推断Histone 4存在信号肽；HP(见中插彩版图4左下)的C=0.163，S=0.616，Y=0.256，D=0.369，推断Hypothetical protein(HP)不存在信号肽；Ribosomal protein(见中插彩版图4右下)的C=0.131，S=0.510，Y=0.212，D=0.292，推断Ribosomal protein不存在信号肽。

图4 外分泌性蛋白的信号肽分析

利用Immunomedicine Group在线软件(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)预测以上所得到的4种蛋白潜在的抗原决定簇，结果发现Hsp90(图5左上)，Histone 4(图5右上)，HP(图5左下)和Ribosomal protein(图5右下)均存在有许多连续的峰值，这些峰值指代潜在的抗原表位，Hsp90存在24个潜在的抗原表位；Histone 4存在4个潜在的抗原表位；HP存在5个潜在的抗原表位；Ribosomal protein存在5个潜在的抗原表位。

利用Phyre2在线软件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)对以上所得4种蛋白的三维结构进行预测，蛋白三维结构模型如图6所示。经在线软件分析4种蛋白三维结构模型的可信度分别是100%、100%、99.9%和99.9%，说明4种蛋白模型具有很高的可信度。

图5 外分泌性蛋白的抗原表位分析

图6 外分泌性蛋白的三维结构预测

3 讨论

因生物信息学与传统的统计学方法相比，具有高效和低成本的特点[7]，故如今用生物信息学分析预测未知蛋白的生物学功能、结构和其他生物特性的研究越来越多。鸡球虫病是我国严重危害养禽业的常见疾病之一，每年都会造成养鸡业的巨大的经济损失，所以对鸡球虫病的防治不可轻视。

E.tenella入侵宿主细胞的过程需要通过粘附、侵入、形成纳虫空泡后寄生于宿主细胞内，而在它的寄生过程之中，行使主要入侵作用的蛋白分子可能就是我们免疫预防研究中的主要球虫疫苗抗原。故本试验通过用Transwell小室将E.tenella第二代裂殖子和MDBK细胞隔离共培养12 h后，收集蛋白培养液上清，以此来获得主要的外分泌蛋白分子，通过一系列生物信息学分析预测这些蛋白作为球虫疫苗候选抗原的可能性。

本试验通过生物信息学分别分析4种蛋白的二级结构、跨膜结构域、亲疏水性、信号肽、抗原表位以及三维结构，在利用SOPMA分析二级结构时发现，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein的二级结构主要是由α-螺旋、无规则卷曲以及β-转角所构成的，且均没有β-折叠，在蛋白质的二级结构中，α-螺旋和β-折叠的结构相对稳定，而无规则卷曲和β-转角的结构较为松散又不稳定，就能更好的与抗体结合，参与免疫反应[8]，以上结构分析结果说明4种蛋白均有作为抗原的结构潜力。在利用TMHMM做跨膜结构域分析时，横坐标指的是序列位置，纵坐标指的是几率[9]，结果发现4种蛋白的膜内区域几率均极低，而膜外区域几率都很高，说明这4种蛋白均无跨膜区。蛋白质的亲疏水性是构成蛋白质折叠的主要驱动力。蛋白质折叠时会形成疏水内核和亲水表面，同时有潜在跨膜区出现高疏水值区域，据此可以测定跨膜螺旋等二级结构和蛋白质表面氨基酸分布[10]。在利用Protscale做亲疏水性的分析中，认为位于1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，反之位于-1.0～-3.0的区域即亲水性较强的区域，结果发现4种蛋白多肽链均具有极强的疏水性。在利用SignalP做信号肽分析时，C值最高峰值是指该位点很可能是剪切位点，Y值最高峰值是指最佳的剪切位点，S值则用来区分该位点是否为信号肽部位，D值是S-mean和Y-max的加权平均值，可以用来区分分泌及非分泌蛋白，分泌性蛋白计算值高，反之则低[11]。结果发现Hsp90和Histone 4存在信号肽，分别在16～17和17～18氨基酸之间可能存在最佳剪切位点，而HP和Ribosomal protein则不存在信号肽。在利用Immunomedicine Group做抗原表位分析时发现，4种蛋白均存在抗原表位，Hsp90存在24个潜在的抗原表位，Histone 4存在4个潜在的抗原表位，HP存在5个潜在的抗原表位，Ribosomal protein存在5个潜在的抗原表位，抗原表位的存在说明4种蛋白作为抗原均能够引起良好的免疫反应，故这些蛋白有可能成为柔嫩艾美耳球虫最为重要的潜在药物靶点或疫苗候选抗原。最后对4种蛋白三维结构建模，结果显示，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein主要是由α-螺旋、无规则卷曲以及β-转角组成，与各蛋白相应的二级结构预测结果相一致，且可信度高，基本能够反映4种蛋白的空间构象。这4种蛋白三维结构模型的构建有利于可视化分析，也为今后研究其构效关系提供了理论基础。

通过间接共培养获得的这4种蛋白，Hsp90是具有高度保守性的蛋白质，在基因转录和细胞生长、分化等方面均发挥着重要作用。有研究发现，鸡堆型艾美耳球虫Hsp90能够提高鸡的免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫[12]。Histone 4是真核生物染色质的基本结构蛋白，当细胞坏死时会被释放到细胞外发挥炎症作用[13]。Histone 4是真核生物染色质的基本结构蛋白，当细胞坏死时会被释放到细胞外发挥炎症作用。在其他顶复门原虫，如发现Histone能够与外周网状物质结合将利什曼原虫在细胞外杀死[14]，说明它具有杀死细胞外细菌或外来物质的作用。Ribosomal protein是参与生物系统发育与分化的重要蛋白。在利什曼原虫发现能保护机体引起T细胞的分泌[15]；在日本血吸虫被发现具有免疫保护效果[16]。这些研究表明，这3种蛋白都被发现能够作为抗原引起机体的免疫应答。而HP的功能至今虽还不清楚，但通过生物信息学分析发现HP不存在信号肽，存在抗原表位，且具有易于发生结合反应的结构。

总的来说，结构分析发现4种蛋白均无跨膜区，主要由α-螺旋、无规则卷曲以及β-转角组成，这种结构导致蛋白不稳定，易发生免疫反应。抗原表位分析发现4种蛋白均存在抗原表位，这说明它们均能够引起良好的免疫反应。且其他顶复门原虫的Hsp90、Histone 4和Ribosomal protein均被研究出具有免疫原性。综上推测这4种蛋白有望成为重要的潜在药物靶点或疫苗候选抗原。

在获得的4种蛋白中，HP蛋白因具有以下几个特点被认为具有作为疫苗候选抗原的可能性，首先HP蛋白还未被研究过；其次HP蛋白无信号肽，目的蛋白就不会进行定位，同样，目的蛋白就不会有信号肽被细胞识别切除，从而使得外源表达目的蛋白能够正确折叠以及提高了外源表达蛋白时的分泌性效率[17-18]，故接下来会通过外源表达对HP蛋白进行研究，预测其成为新型疫苗的候选抗原的可能。