吴丽娜 朱峰 徐铖 叶恩如

大肠癌是世界范围内最常见的癌症类型之一，中国 每年有200万新诊断病例。近年来，虽然在卫生保健和筛查手段方面有所改进，但是大肠癌相关死亡的新病例数量却在逐年增加[1-2]。大肠癌的高发病率和高死亡率提示，研究其发病机制对于改善大肠癌治疗现状具有重要的临床意义。脂肪非典型钙黏蛋白4（fat atypical cadherin，FAT4）属于钙黏蛋白超家族成员之一，作为跨膜蛋白受体可以将上游Hippo信号通路的细胞外信号传导至细胞内。研究证实FAT4对恶性肿瘤有抑制作用，FAT4基因失活可能与启动子的甲基化有关[3]，外周血白细胞FAT4异常甲基化和基因-环境相互作用与胃癌的风险相关[4]。Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信号通路的关键组成部分，在人体生长、发育、修复和体内平衡中起重要作用[5-6]。越来越多的证据表明YAP在胃癌[7]、乳腺癌[8]等多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的进展有关。本研究采用免疫组化En Vision法检测FAT4和YAP在大肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，分析大肠癌组织中FAT4和YAP的表达及其与临床病理特征和预后的关系，旨在探讨FAT4和YAP的表达是否参与大肠癌的发生、发展过程及对预后的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年1月至2014年12月在本院行手术切除的大肠癌标本80例，术后均经病理明确诊断，术前均未接受放疗、化疗及生物治疗。80例患者中男 45 例，女 35 例；年龄 31～79（61.46±10.25）岁；肿瘤直径≥5.0cm 31例，＜5.0cm 49例；组织学分级：高中分化55例，低分化25例；浸润深度：未侵及浆膜30例，侵及浆膜50例；淋巴结转移36例，无转移44例；参照2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会修订的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期48例。同时以癌旁（距肿瘤原发灶＞5cm）组织作对照，病理检查证实均为正常大肠组织。

1.2 主要试剂 兔抗人FAT4多克隆抗体购自美国Novus Biologicals公司，鼠抗人YAP单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，En Vision通用试剂盒和DAB显色剂均购自丹麦Dako公司。

1.3 检测方法大肠癌组织和癌旁正常组织标本离体后立即用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋。采用免疫组化En Vision法进行染色，严格按照说明书要求进行操作。高压锅及柠檬酸修复液（pH 6.0）抗原修复，正常山羊血清封闭30min，一抗4℃过夜，二抗孵育30min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。用已知阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 FAT4和YAP染色阳性信号为出现黄色或棕褐色颗粒，FAT4定位于细胞质或细胞核，YAP定位于细胞核。选取5个以上高倍视野（×400），观察并记录每张切片的染色强度和面积，通过半定量积分法进行判定。染色强度：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数百分比：阳性细胞数百分比≤5%为0分，6%～10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分。细胞染色强度与阳性细胞百分比计分的乘积为每例的最终积分。＜2分为阴性，≥2分为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以 表示；计数资料组间比较采用χ2检验。采用Spearman等级相关分析FAT4和YAP表达的相关性。采用Kaplan-Menier法计算生存率，以log-rank法比较组间生存率的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌组织和癌旁正常组织中FAT4和YAP的表达 FAT4阳性表现为细胞质或细胞核出现黄色或棕褐色颗粒，YAP阳性表现为细胞核内出现黄色或棕褐色颗粒，见图1。大肠癌组织中FAT4阳性表达率为32.50%（26/80），明显低于癌旁正常组织的66.25%（53/80），差异有统计学意义（χ2=18.227，P＜0.01）。大肠癌组织中YAP阳性表达率为61.25%（49/80），明显高于癌旁正常组织的13.75%（11/80），差异有统计学意义（χ2=38.506，P＜0.01）。

图1 大肠癌组织和癌旁正常组织中FAT4和YAP的表达（a：FAT4在大肠癌组织中阳性表达；b：FAT4在癌旁正常组织中阳性表达；c：YAP在大肠癌组织中阳性表达；d：YAP在癌旁正常组织中阴性表达；En Vision染色，×400）

2.2 大肠癌组织中FAT4和YAP表达与临床病理特征的关系 FAT4阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期均有关（均P＜0.01），而与患者性别、年龄、肿瘤直径和分化程度均无关（均P＞0.05）。YAP阳性表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移均有关（均P＜0.01），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度和TNM分期均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 大肠癌组织中FAT4和YAP表达与临床病理特征的关系

2.3 大肠癌组织中FAT4和YAP表达的相关性 经Spearman等级相关分析，大肠癌组织中FAT4的表达和YAP 的表达呈负相关（r=-0.434，P＜0.01），见表 2。

表2 80例大肠癌组织中FAT4和YAP表达的相关性（例）

2.4 大肠癌组织中FAT4和YAP的表达与患者预后的关系 80例大肠癌患者均采用电话随访3年，存活48例，死亡32例。FAT4表达阳性者3年生存率为84.62%，明显高于FAT4表达阴性者的48.15%，差异有统计学意义（χ2=9.720，P＜0.01）；YAP表达阳性者 3年生存率为44.89%，明显低于YAP表达阴性者的83.87%，差异有统计学意义（χ2=12.020，P＜0.01）。

3 讨论

许多发育基因参与细胞增殖和细胞凋亡的调控失衡。FAT基因家族是钙黏蛋白超家族的成员，在果蝇发育过程中调控细胞增殖和细胞极性[9]。FAT家族包含FAT1、FAT2、FAT3和FAT4 4个成员。FAT4基因编码超过5 000个氨基酸的巨大跨膜蛋白。该基因是Hippo信号通路的成员，在调节器官大小方面具有重要作用。该信号通路的下游部分可以诱导转录共激活因子[YAP/具有PDZ结合基序（TAZ）]调节细胞增殖，逃避细胞凋亡。此外，FAT4在多种肿瘤中低表达，是肿瘤的抑制基因[10-12]。与正常对照组织比较，胃腺癌组织中FAT4表达减少。FAT4表达下调与肿瘤分级有关，晚期分级中有较高的抑制作用。FAT4表达降低及其启动子甲基化增加可能是将正常的胃组织转变为肿瘤组织的有效过程之一[13]。本研究显示，大肠癌组织中FAT4阳性表达率明显低于癌旁正常组织，且FAT4阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期均有关。生存分析显示，FAT4表达阳性者3年生存率明显高于FAT4表达阴性者，提示FAT4表达阴性者预后差。表明FAT4蛋白表达下降可能在大肠癌的发生、浸润及转移过程中起作用，进一步提示FAT4是大肠癌的抑制基因，与上述研究结果类似。

YAP是Hippo信号通路的核心效应因子，在调控细胞增殖和凋亡及组织器官大小方面起着重要作用。YAP进入细胞核后作为转录共激活因子与TEA域家族成员1（TEAD1）结合，诱导靶基因表达，进而在调节细胞增殖和凋亡、上皮间质转化及癌变过程中起作用[14]。Wang等[15]发现在肝细胞癌（HCC）组织中，YAP表达明显增加，并且其过表达与肿瘤分化程度相关。通过小干扰RNA沉默YAP导致HCC细胞生长的抑制，这与促进细胞凋亡有关。YAP的沉默还降低了HCC细胞的侵袭潜力，增加了HCC细胞对顺铂的化学敏感性。总之，这些结果表明YAP在HCC中过表达，并促进HCC细胞的增殖、侵袭和耐药性。本研究显示，大肠癌组织中YAP阳性表达率明显高于癌旁正常组织，且YAP阳性表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移均有关。生存分析显示，YAP表达阳性者3年生存率明显低于YAP表达阴性者，提示YAP表达阳性者预后差。

在胃癌细胞中采用短发夹状RNA沉默FAT4，发现FAT4抑制导致YAP的磷酸化和YAP核积聚增加，这与促进细胞增殖、迁移和细胞周期进展相关。进一步将全长FAT4转染到FAT4沉默细胞中，发现YAP磷酸化的减少和细胞周期进程的抑制[16]。表明胃癌组织FAT4表达下降，可以抑制YAP的磷酸化和促进YAP进入细胞核，导致YAP在细胞核中表达上调，进而参与胃癌的侵袭、转移。FAT4和YAP在大肠癌的相互作用如何，目前还不清楚。本研究发现大肠癌组织中FAT4的表达和YAP的表达呈负相关，提示FAT4和YAP是一对拮抗因素，FAT4可能通过上调YAP的表达，参与大肠癌的发生、发展，这与上述胃癌中的研究结果一致。

综上所述，大肠癌组织中FAT4表达降低，而YAP表达升高，其异常表达均与大肠癌的浸润、转移有关。FAT4的表达和YAP的表达呈负相关，FAT4表达阳性者较阴性者预后好，而YAP表达阳性者较阴性者预后差，两者异常表达可能与大肠癌的发生、发展及预后密切相关。FAT4和YAP在大肠癌发生、发展过程中如何调控及调控的具体机制如何需要从细胞培养及体外实验进一步阐明。