权 亮，陈志敏,4，赵永峰，李文兵，胡昌江,2*

(1.成都中医药大学，四川 成都 611137；2.国家中医药管理局“中药配方颗粒质量与疗效评价”重点研究室，四川 成都 611900；3.四川新绿色药业科技发展有限公司，四川 成都 611900；4.成都市中草药研究所，四川 成都 610016)

郁金为姜科植物温郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)、姜黄(C.longaL.)、广西莪术(C.kwangsiensisS.G. Lee et C. F. Liang)或蓬莪术(C.PhaeocaulisVal.)的干燥块根，依次被习称为温郁金、黄丝郁金、桂郁金和绿丝郁金[1]。郁金醋制品在临床中应用广泛，绿丝郁金作为郁金的重要来源，其现有炮制工艺研究几乎没有，因此亟需对其炮制工艺进行优化，规范绿丝郁金醋制品的质量控制。

本实验在单因素考察的基础上，采用Plackett-Burman试验法结合BBD响应面法优化绿丝郁金醋制工艺。本课题组在前期大量研究时发现，莪术呋喃二烯酮是绿丝郁金的特征成分，且含量相对吉马酮更高，遂以吉马酮及莪术呋喃二烯酮含量为指标，基于信息熵赋权法[2-6]，考察稀释加水量(A)、闷润时间(B)、炮制温度(C)、炮制时间(D)对综合评分值的影响，以优化绿丝郁金的醋制工艺[7-8]，为其规范化生产提供依据。

1 仪器与材料

SHIMADZU LC-2030C 3D高效液相色谱仪(日本岛津公司)；超声波清洗机(40 kHz，300 W，昆山市超声仪器有限公司)；FA1204C型电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；Shimadzu AUW220D型电子分析天平(日本岛津公司)；吉马酮对照品(批号：111665-201605，质量分数99.8%)，莪术呋喃二烯酮(批号:100185-201007，质量分数99.9%)，均购自中国食品药品检定研究院；市售9°米醋(总酸≥9.00 g/100 mL)；绿丝郁金购于成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为蓬莪术的干燥块根。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 吉马酮及莪术呋喃二烯酮定量分析方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱Shim-pack gIST C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(60∶40)；PDA检测器，检测波长210 nm；柱温35 ℃；体积流量为0.8 mL·min-1；进样体积为10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取吉马酮及莪术呋喃二烯酮适量，置于10 mL量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容至刻度，分别制成质量浓度为1.20 mg·mL-1、1.13 mg·mL-1的对照品溶液。混合对照品及绿丝郁金样品色谱见图1。

图1 混合对照品溶液及样品HPLC

2.1.3 供试品溶液制备 精密称定样品粉末(过3号筛)5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，取出放冷后用甲醇补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 精密吸取吉马酮及莪术呋喃二烯酮对照品溶液，进行逐级稀释，即吉马酮浓度为(60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 μg·mL-1)，莪术呋喃二烯酮浓度为(453.20、226.60、113.30、56.65、28.33 μg·mL-1)进样10 μL，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，其回归方程为吉马酮Y=18444X-13408，R2=0.9996；莪术呋喃二烯酮Y=4260.6X-12939，R2=0.9997。结果表明吉马酮及莪术呋喃二烯酮在3.75～60 μg、28.33～453.20 μg进样量范围内与其峰面积线性关系良好。

2.2.2 精密度实验 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定对照品的峰面积，结果吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积RSD值分别为0.31%、0.39%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h进样10 μL，测定并记录峰面积。结果吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积RSD值分别为0.36%、0.52%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4 重复性实验 取同一批样品6份，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，在“2.1.1”色谱条件下进行测定并记录峰面积。计算得到吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积RSD值分别为1.44%、0.71%，表明该方法重复性良好。

2.2.5加样回收率实验 取6份已知含量的样品2.5 g，精密称定，按照样品∶对照品=1∶1的比例分别精密加入对照品溶液，用甲醇补足25 mL。按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下分析，测定峰面积，计算回收率，结果表明吉马酮及莪术呋喃二烯酮平均加样回收率分别为105.9%、99.7%，RSD分别为1.20%、1.31%，表明该方法准确度良好。

2.3 单因素实验

取炮制后的样品按“2.1.3”项下方法制备，在“2.1.1”项色谱条件下进样分析,测定吉马酮及莪术呋喃二烯酮含量。以吉马酮及莪术呋喃二烯酮含量最高为指标，选取最适宜的单因素水平。

2.3.1 稀释加水量 本课题组在前期对黄丝郁金的工艺优化中，确定米醋最佳用量为10%，此结果与《全国炮制规范》[9]中记载一致，因此，此次用醋量也取10%。但考虑到绿丝郁金饮片质地的不同，将稀释加水量作为考察因素，考察其对成分含量的影响。

称取绿丝郁金4份，每份50 g，加入0%、5%、10%、15%的水对米醋进行稀释，将稀释后的米醋与药材拌匀，闷润10 min，将药材置于锅内，在140 ℃下炒制10 min。分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积，计算得到其含量。结果表明,两者含量呈增加趋势，在5%的加水量下达到最大值，继续增加时含量增势减慢，因此最佳加水量为5%，即每100 g绿丝郁金，加入10 mL米醋与5 mL水的混合液进行炮制。

2.3.2 闷润时间 称取绿丝郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋与2.5 mL水的混合液，分别闷润5、10、15、20 min，将药材置于锅内，140 ℃炒制10 min。分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积，计算得到其含量。结果表明，两者含量随闷润时间的增加而增加，在15 min时达到最大值，因此最佳闷润时间为15 min。

2.3.3 炒制时间 称取绿丝郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋与2.5 mL水的混合液，闷润15 min，将药材置于锅内，在140 ℃下分别炒制5、10、15、20 min。分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积，计算得到其含量。结果表明，两者含量在10 min时达到最大值，因此最佳炒制时间为10 min。

2.3.4 炒制温度 称取绿丝郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋与2.5 mL水的混合液，闷润15 min，将药材置于锅内，分别于100、120、140、160 ℃下，炒制10 min。分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定吉马酮及莪术呋喃二烯酮峰面积，计算得到其含量。结果表明，两者含量随炒制温度的增加而增加，在140 ℃时达到最大值，继续增加时，含量反而降低，因此最佳炒制温度为140 ℃。

2.4 PB试验设计筛选影响绿丝郁金醋炙工艺的显著因素

2.4.1 炮制方法 取绿丝郁金饮片，用量筒加入适量米醋拌匀，闷润，在一定温度下炒制一定时间，取出，晾干，即得。

2.4.2 PB实验因素水平 综合单因素试验结果，运用Design-Expert软件设计12次的PB试验[10-14]，对稀释加水量(A)、闷润时间(B)、炒制温度(C)和炒制时间(D)进行显著性考察，每个因素设计高低两个水平，分别用1、-1表示。因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平

2.4.3 试验结果 本实验以吉马酮及莪术呋喃二烯酮含量为指标，结合信息熵赋值法，由Matlab程序，输入原始评价指标矩阵(X)，再转化为概率矩阵(P)。具体数据如下。

X=0.44300.25920.99600.82970.56820.40860.01880.19740.14460.00200.36090.99600.78970.48170.21980.60280.02520.20970.00200.19450.68450.48260.79450.1689

P=0.08780.05360.19730.17170.11260.08450.00370.04080.02870.00040.07150.20610.15650.09970.04360.12470.00500.04340.00040.04020.13560.09990.15740.0349

应用程序得出第I项指标的系数Wi[0.595 6、0.404 4]。综合评分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn×Wn，即吉马酮及莪术呋喃二烯酮质量分数的权重系数分别为0.5956、0.4044。加权综合评分结果见表2，方差分析见表3。

表2 Plackett-Burman试验设计与结果

表3 方差分析

注:*P<0.05。

从表3可得闷润时间和炒制时间对绿丝郁金醋炙工艺影响显著，显著性大小排序为炒制时间(D)>闷润时间(B)>稀释加水量(A)>炒制温度(C)，稀释加水量和炒制温度对绿丝郁金醋炙工艺影响不显著。结合单因素实验结果，炒制温度选择为140 ℃，采用BBD-RSM法进一步考察稀释加水量(A)、闷润时间(B)及炒制时间(D)对绿丝郁金醋炙的影响。

2.5 BBD响应面法对绿丝郁金醋炙工艺的优化

2.5.1 因素水平 根据单因素试验和PB试验结果，选取稀释加水量(A)、闷润时间(B)及炒制时间(D)为因素，每个因素选取三个水平，选择吉马酮及莪术呋喃二烯酮的综合评分为响应值。具体BBD-RSM因素水平见表4。

表4 BBD-RSM试验因素水平

2.5.2 试验结果 BBD-RSM结果处理方法同上，得到第i项指标的系数Wi[0.4174、0.5826]。综合评分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn/Wn，即吉马酮及莪术呋喃二烯酮含量的权重系数分别为0.4174、0.5826，概率矩阵(P)如下。加权综合评分结果见表5。利用Design-Expert 8.0.6软件进行分析方差分析，方差分析见表6。

X=0.8055 0.0020 0.7949 0.3146 0.5113 0.4389 0.4792 0.6645 0.7194 0.4283 0.5117 0.9960 0.3853 0.4885 0.71060.8633 0.0020 0.8372 0.3077 0.1865 0.3111 0.6091 0.6559 0.7609 0.2497 0.6210 0.9960 0.3921 0.6275 0.7678

表5 BBD-RSM实验设计及结果

各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为R1=-0.43789+3.45667E-003A+0.051778B+0.018406D+6.0E-006AB-1.12E-004AD-1.59E-004BD+2.07833E-004A2-1.59717E-003B2-6.33167E-004D2。由表6可知，模型具有显著性，R2为0.9488，失拟项不显著，表明该模型拟合度较好。利用Design-Expert 8.0.6软件，根据拟合模型绘制三维曲线图，了解各因素的交互作用对综合评分的影响。见图2。

表6 方差分析

图2 稀释加水量、闷润时间和炒制时间对综合指标的响应面

由Design-Expert分析可得，当出现最大响应值时，工艺条件为加水稀释量为9.97%，闷润时间为15.96 min，炒制时间为11.02 min。考虑到实际操作问题，将最佳工艺条件优化为加水稀释量为10%，闷润时间16 min，炒制时间11 min。

2.6 验证试验

为检测上述结果，需要对最佳工艺进行验证。设计3组验证试验，在加水稀释量为10%，闷润时间16 min，炒制温度为140 ℃，炒制时间11 min条件下进行验证，结果见表7。吉马酮及莪术呋喃二烯酮的含量均较高，说明该工艺符合实际工艺要求。

表7 工艺验证

3 讨论

为优化绿丝郁金醋炙工艺，保证炮制品质量稳定可控，在前期单因素实验的基础上，采用PB设计联用BBD响应面法优化绿丝郁金醋炙工艺。通过PB实验筛选出对工艺有显著影响的因素，再用BBD响应面法进一步优化，使结果精确度更高、指导性更强。

同时，本课题组在前期对绿丝郁金的研究中发现莪术呋喃二烯酮为绿丝郁金的特征成分，且其含量高于吉马酮，遂将吉马酮与莪术呋喃二烯酮的含量作为指标，信息熵赋权法具有的客观性和直观性避免了人为赋权重带来的主观性问题，使结果更精确。同时，采用Matlab程序进行信息熵赋权，结果直观易分析，且稳定可靠。

通过客观赋值的信息熵赋值法进行数据处理，以综合评分值作为醋郁金炮制工艺的评价标准，使得数据能更准确反映炮制过程对其质量的影响，可为郁金醋炙品的产业化生产和规范化质量控制提供依据，也为后续醋郁金的质量标准及药效学研究奠定了基础。