李燕 周雄坤 刘静 苟亚军

胃癌作为全球第二大恶性肿瘤，每年有超过100万的新发病例[1]。由于饮食习惯的问题，中国是胃癌的高发国家，2017年有近70万新发病例，且大部分患者诊断时已为进展期胃癌，易侵袭转移，死亡率较高[2]。胃癌早期症状不明显，因此寻找胃癌的特异性诊断标志物并探究其机制对于胃癌的治疗、诊断具有重要意义。

越来越多的研究表明，lncRNA在癌症的发生发展过程中起到了重要作用，其能够调节细胞功能[3]。已经有文献表明，一系列lncRNA能够调节癌症相关通路，甚至可以作为预后评价标志物或者治疗靶点[4]。巨噬细胞是许多肿瘤的重要细胞成分，一般将这种巨噬细胞命名为肿瘤相关性巨噬细胞或癌支持巨噬细胞，有研究表明其对于肿瘤的发展有促进作用[5-7]。有研究表明，lncRNA Hotair在胰腺癌中表现出促癌性质，与预后较差相关[8]。本研究，发现胃腺癌细胞能够通过lncRNA Hotair将肿瘤中的巨噬细胞转变为癌支持巨噬细胞，并且局促进癌细胞的增殖与侵袭，从而促进胃癌的发展，有可能为胃腺癌的早期诊断与治疗提供新的靶点。

材料与方法

一、实验材料

1.组织样本：从陆军军医大学第一附属医院2015至2017年住院的胃腺癌患者中随机选出30 例纳为本次研究对象。排除标准：（1）严重心脏、肝脏、肾脏、肺功能不全；（2）合并感染、肿瘤、免疫性疾病；（3）合并血液系统疾病。该研究通过了西南医院伦理委员会的批准（伦理号：20151024），所有患者都签署了知情同意书。所有组织在切除后立即冰冻并保存于-80℃，以备进一步实验。

2.细胞系：AGS人胃腺癌细胞（北京北纳生物公司）。

3.实验试剂：DMEM/F12培养基（美国Sigma公司），胎牛血清（美国Gibco公司），Lipofectamine 2000（美 国 Invitrogen 公 司），IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 与 IL-10 ELISA 试剂盒，Hotair质粒与siRNA（中国吉玛基因公司）。

4.实验动物：3月龄SD大鼠来自陆军军医大学第一附属医院实验动物中心。

二、实验方法

（一）胃癌细胞系培养与转染

AGS人胃腺癌细胞购自北京北纳生物公司。细胞培养于含10%胎牛血清与1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，培养环境37℃，含5% CO2。使用Lipofectamine 2000作为转染试剂，lncRNAHotair或干扰RNA以50 nmol/L的浓度加入每孔细胞。Hotair特异性引物为：上游：5'-CATG GATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3'；下 游：5'-ACTCTCGAGCCACCACACACACACAA CCTACAC-3'。HotairsiRNA序列为：5'-GCGCCUUCC UUAUAAGUAUTT-3'。Hotair质粒与 siRNA都由吉玛基因合成。细胞分为空白对照组、Hotair过表达组与RNA干扰组。

（二）巨噬细胞分离与培养

巨噬细胞从大鼠腹腔中提取。首先将含有青霉素和链霉素的PBS溶液注射入SD大鼠腹腔并揉搓腹部，2 min后从腹部抽取出液体并以300×g转速离心5 min。随后细胞重悬于红细胞裂解液中2 min。再次离心后将巨噬细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，3 h后去除没有贴壁的细胞，更换新的培养基。培养基每2天更换1次。

（三）共培养实验

巨噬细胞与AGS人胃腺癌细胞的共培养实验使用Transwell小室完成。对照组为：巨噬细胞以1×105个/孔的密度加入 24 孔 Transwell板上室（孔径0.4 μm），AGS细胞组在对照组基础上，AGS细胞以同样密度加入下室，共培养3 d，进行后续检测。

（四）指标检测

1.细胞侵袭实验：使用Matrigel基质胶包被的Transwell小室测定AGS细胞的侵袭迁移能力。加100 μl无血清培养基AGS细胞悬液至Transwell上室，600 μl培养基（10%血清）加入下室。24 h后取出小室，PBS溶液洗涤后甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，镜下观察。

2.细胞增殖检测：使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。各组的AGS细胞贴壁于96孔板并培养48 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养2 h，使用酶标仪测定459 nm处吸光度。

3.细胞免疫荧光染色：各组巨噬细胞种植于细胞爬片，使用4 %多聚甲醛固定后，CD86一抗4 ℃孵育过夜。随后使用Alexa Fluor 568标记的二抗室温染色1 h。使用同样的方法标记细胞表面CD206。最后使用蔡司荧光显微镜观察拍照。

4.胃癌组织原位杂交实验：对于石蜡包埋的胃癌组织切片，首先使用10 mmol/L的柠檬酸溶液煮沸10 min修复抗原，使用Triton X-100透膜。使用浓度为2 ng/μl荧光标记的HotaircDNA探针溶液孵育24 h。随后使用CD206抗体对巨噬细胞进行免疫荧光染色，以进行巨噬细胞与lncRNA Hotair的共定位。

5.酶联免疫吸附测定：在96孔板细胞生长至数量为5×105个之后，使用ELISA实验检测各项炎症相关因子的水平。首先使用标准品绘制各个因子的标准曲线。各组细胞培养24 h后取上清液，按照双抗夹心法实验步骤进行IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 与 IL-10 浓度检测。

6.流式细胞术：使用流式细胞术检测巨噬细胞的表型转化。各组细胞使用APC标记的CD86抗体与FITC标记的CD206抗体进行染色。染色完成后每组取约1×105个细胞重悬于100 μl流式缓冲液中，使用Accuri C6流式细胞仪进行检测，实验结果使用FlowJo软件进行分析。

7. RNA提取与定量RT-PCR：使用TRIzol提取细胞中的RNA。使用cDNA合成试剂盒合成cDNA第一链。随后使用SYBR Green I染料在CFX Connect荧光定量PCR检测系统中进行RT-PCR，以GAPDH做归一化处理。引物序列如下：GAPDH上游引物：5'-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3'，下游：5'-ATTCGGAGAAGGGAGGGCT-3'；PICSAR：上 游：5'-TGCCTGGACTTTCAAGAGGTAA-3'，下游：5'-GCTCTCAGTCAGCAGACACTT-3'。

8.细胞增殖检测：使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。Transwell上室AGS细胞贴壁于培养48 h后，每孔加入30 μl CCK-8试剂，继续培养2 h，使用酶标仪测定450 nm处吸光度。

三、统计学分析方法

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，细胞数量、吸光度值、RNA含量等指标以x± s表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、胃腺癌细胞将巨噬细胞转化为抗炎型癌支持细胞

为了确定胃腺癌细胞对邻近巨噬细胞的影响，本研究进行了共培养实验，AGS胃腺癌细胞与巨噬细胞共培养于Transwell板中。3 d后使用免疫荧光染色检测CD206与CD86阳性细胞数量。结果表明，AGS细胞组中，CD206阳性巨噬细胞数量（32.51±5.44）个多于对照组（5.63±1.97）个，而CD86阳性细胞数量降低，表明实验组中更多的巨噬细胞转变为癌支持细胞（图1、表1）。

表1 两组巨噬细胞不同表型数量（个，± s）

表1 两组巨噬细胞不同表型数量（个，± s）

分组 样本量 CD86 CD206对照组 3046.82±7.455.63±1.97 AGS 细胞组 307.86±2.4432.51±5.44 t 值 27.46425.742 P值 0.0010.001

随后的ELISA实验也印证了这一结论，AGS细胞组巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6三种炎性因子水平降低，而TGF-β、IL-4和IL-10三种抗炎因子水平升高（表2）。

二、胃腺癌细胞通过长链非编码RNA Hotair作用于巨噬细胞

图1 倒置荧光显微镜观察两组胃腺癌细胞对邻近巨噬细胞的影响（免疫荧光染色，×400）

表2 两组炎症相关因子水平检测（pg/ml，± s）

表2 两组炎症相关因子水平检测（pg/ml，± s）

分组 样本量 IL-6 TNF-α IL-1β TGF-β IL-4 IL-10对照组 30986.51±239.132986.43±731.21567.92±143.4787.32±19.2449.94±17.5698.82±46.26 AGS 细胞组 30321.63± 96.32998.34±314.73212.41±101.24163.45±54.91156.83±69.25385.65±24.75 t 值 14.13613.68011.0947.1678.20329.991 P值 0.0010.0010.0010.0010.0010.001

本研究首先从GEO数据库中筛选出胃癌组织与邻近正常组织表达差异最大的两种lncRNA：lncRNA Hotair与lncRNA PICSAR。AGS细胞组采用巨噬细胞与AGS细胞共培养于Transwell小室的方案，对照组去除下室的AGS细胞，采用相同的培养基。随后进行RT-PCR实验检测共培养体系中巨噬细胞内两种lncRNA的表达水平。结果表明，共培养的巨噬细胞内lncRNA Hotair水平高于对照组，而lncRNA PICSAR与对照组之间差异无统计学意义（表3）。随后的原位杂交实验结果表明，胃癌组织中的CD206阳性巨噬细胞与Hotair有较强相关性，其中红色为CD206，绿色为Hotair定位，两者能够共定位（图2）。

表3 巨噬细胞两种lncRNA相对水平检测

三、长链非编码RNA Hotair将巨噬细胞转变为癌支持细胞

首先检测了转染Hotair质粒的Hotair过表达组或转染Hotair siRNA的RNA干扰组中AGS细胞Hotair相对含量，Hotair过表达组的Hotair相对含量为0.78±0.12，高于对照组的0.39±0.06（P＜ 0.05），而 RNA 干 扰 组 的 Hotair含 量 降 低（0.14±0.02，P＜ 0.01），表明转染成功。随后使用流式细胞仪对各组AGS细胞共培养体系中的巨噬细胞表型进行检测，结果表明，相对于对照组，Hotair过表达组中含有更多的CD206阳性细胞，而RNA干扰组CD86阳性细胞更多（图3，表4）。

随后，巨噬细胞分别转染Hotair质粒或Hotair siRNA后与AGS细胞共培养，Transwell上室包被了Matrigel，以验证AGS细胞的侵袭能力和增殖能力。实验结果表明，Hotair过表达组视野内侵袭到下室的细胞数量为（326.90±34.62）个，高于对照组（174.81±24.24）个，（P＜ 0.01），而 RNA 干扰组细胞侵袭数量为（126.78±21.85）个，相比对照组差异具有统计学意义（P＜ 0.01，表4）。转染了Hotair质粒的细胞增殖能力显著高于未转染的对照组；相反，转染siRNA之后细胞增殖能力则显著降低（P＜0.01，表4）。

讨 论

中国是胃癌的高发国家，且大部分患者诊断时已为进展期胃癌，死亡率较高。胃癌早期症状不明显，因此寻找胃癌的特异性诊断标志物并探究其机制对于胃癌的治疗、诊断具有重要意义[9]。

图3 Hotair将巨噬细胞转变为癌支持细胞

表4 各组流式细胞各表型细胞比例、450 nm吸光度与侵袭细胞数量

局部微环境对于肿瘤的发展与转移有重要作用，肿瘤细胞通过多种方式改变周围环境从而有利于自身发展[10]。肿瘤相关巨噬细胞近些年受到关注，巨噬细胞原本为促炎M1表型，但肿瘤中的巨噬细胞在肿瘤细胞作用下转变为抗炎M2表型的癌支持细胞，从而有利于肿瘤的增殖[11]。长链非编码RNA是肿瘤细胞影响周围环境的重要方式之一，本研究假设胃癌细胞可能通过lncRNA作用于巨噬细胞从而改变其表型。

首先，本研究通过共培养实验，验证了巨噬细胞会在AGS细胞作用下，由CD86促炎型细胞转变为CD206抗炎细胞，ELISA实验也表明，与共培养AGS细胞共培养组的巨噬细胞分泌更少的促炎因子，更多的抗炎因子，进一步证明巨噬细胞的表型转换。为了选出起到这一作用的关键lncRNA，首先从GEO数据库筛选出胃癌细胞与周围正常组织表达差异最大的两种lncRNA：Hotair与PICSAR。本研究测定共培养体系中巨噬细胞内两种lncRNA的含量，结果表明实验组中Hotair水平与对照组有显著差别，而PICSAR无显著差别，表明Hotair可能是起到这一关键作用的lncRNA。于是本研究对AGS进行Hotair转染与RNA干扰实验，证明了敲低Hotair水平会抑制巨噬细胞的表型转换，Hotair转染则相反。对临床样本进行的共定位实验也表明，Hotair与CD206阳性细胞密切相关。为了验证表型转换之后的巨噬细胞对AGS细胞功能的影响，在巨噬细胞被转染Hotair或HotairsiRNA后与AGS细胞进行共培养，结果表明Hotair组的AGS细胞增殖与侵袭能力显著增强，HotairssiRNA组则正好相反。

总而言之，本研究证明了胃癌细胞通过lncRNAHotair促进肿瘤微环境中的炎性巨噬细胞转变为抗炎癌支持细胞，从而促进胃癌的增殖与转移，为胃癌治疗提供了可能的新靶点。