刘国红 刘琴英，2 刘波 车建美 陈倩倩

（1.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003；2. 福建师范大学生命科学学院，福州 350117）

芽胞杆菌（Bacillus）是一种革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧，能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽胞，因此能忍受多种不良环境。芽胞杆菌是土壤微生物的重要组成部分，在土壤生态系统中占有重要地位。有些芽胞杆菌可以在高酸、高碱、高温、高寒等极端环境下良好生长，具有较大的生态学价值。近几年，陆续有关不同生态条件下土壤芽胞杆菌数量和种类分布的研究文献报道。刘国红等［1］报道了新疆伊犁马铃薯土壤中芽胞杆菌多样性，刘琴英等［2］调查了四川海螺沟冰川土样中的芽胞杆菌资源，葛慈斌等［3］首次调查了武夷山各种地衣的表生和内生芽胞杆菌种类多样性，张华勇等［4］对红壤地区不同生态系统下芽胞杆菌属内的物种多样性进行了分析，表明芽胞杆菌的多样性指数、种类丰富度指数和均匀度指数随生境的不同从林地、旱地、水田、侵蚀地呈递减趋势。

四川省生态资源丰富多样，蕴藏着丰富的微生物种类。马健华［5］从四川若尔盖高原37份土样中分离获得78株芽胞杆菌，分别属于芽胞杆菌属（Bacillus）、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）和类芽胞杆菌属（Paneibacillus）3个属。胡容平等［6］调查发现四川甘孜州折多山与雀儿山地区土壤细菌丰富多样，主要优势类群为芽胞杆菌。目前，主要是对四川森林土壤微生物多样性研究［7-9］，专门针对芽胞杆菌种类分布的研究尚未见报道。鉴于此，本研究将对四川和重庆农林生态区林地和农地土壤中芽胞杆菌种类进行调查分析，以期为芽胞杆菌资源开发和利用奠定理论基础和提供菌种保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集 采集深度范围为0-15 cm或0-20 cm。各样点采集的样品采后装入无菌袋内，立即带回实验室供实验分析用。样品的具体信息，见表1。

表 1 供试土样信息

1.1.2 培养基和试剂 PCR仪和凝胶成像分析仪（Bio-Rad公司）；恒温培养箱（BI-250AG）购自施都凯仪器设备（上海）有限公司；2×PCR Master Mix购自上海铂尚生物技术有限公司；引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，pH 7.2-7.4，琼脂15.0 g，水1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞杆菌的分离与鉴定 土壤中芽胞杆菌的分离参考刘国红等［10］描述的方法，将10 g土壤与90 mL无菌水振荡20 min混匀，80℃水浴15 min，依次稀释涂板，30℃培养2 d后进行观察。每份土样重复3次。根据菌落形态特征等进行芽胞杆菌种类归类、统计计数及纯化，采用-80℃甘油冷冻法进行保存。采用Tris-饱和酚法提取芽胞杆菌基因组DNA。采用通用细菌16S rRNA引物进行扩增、测序，主要参考Liu等［11］描述的方法。16S rRNA基因扩增引物为 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。检测出有条带的菌株PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.2.2 芽胞杆菌资源系统发育分析 根据所得到序列在网站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上进行序列比对分析后［12］，初步判断得出芽胞杆菌的分类地位。选择相关的参考菌株序列，再经Clustal X对齐后［13］，用软件Mega 6.0采用邻接法和Jukes-Cantor模型构建系统发育树［14-17］。

1.2.3 芽胞杆菌资源多样性分析 统计农林生态区土壤中芽胞杆菌种类数、菌落数，以芽胞杆菌种类为样本，以菌落数量为指标，采用Ward's方法和欧式距离模型、利用统计软件SPSS 20进行聚类分析。比较分析各样本芽胞杆菌种类的分布情况。采用物种多样性分析常用的指数Pielou均匀度指数、Shannon-Wiener多样性指数和Simpson优势度指数讨论不同采样地嗜碱芽胞杆菌物种多样性。

式中，S为总芽胞杆菌种类数，N为芽胞杆菌个体总数，Pi是第i种的个体数占总个体数的比例。

2 结果

2.1 芽胞杆菌资源的分离与鉴定

从四川和重庆农林生态区采集的5份样本中共分离获得了芽胞杆菌95株，经形态特征比较，除去冗杂菌株，选取57株菌为代表菌株进行下一步分析。经16S rRNA基因序列鉴定，57株菌判断为7个属38个种，其中芽胞杆菌属（Bacillus）22个种、赖氨酸芽胞杆菌属（Lysinbacillus）4个种、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）7个种、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）2个种、嗜冷芽胞杆菌属（Psychrobacillus）1个种、鲁梅尔芽胞杆菌属（Rummeliibacillus）1个种和虚构芽胞杆菌属（Fictibacillus）1个种。其中，芽胞杆菌属为优势种群，包含41株菌，占68.3%，其次为类芽胞杆菌属包含7株，占11.7%。根据国际细菌种的定义标准，两菌间16S rRNA相似性低于98.65%，6株菌可能为潜在芽胞杆菌新种（表2）。

2.2 农林生态区土壤中芽胞杆菌系统发育分析

基于16S rRNA基因序列系统发育分析，农林生态区土壤中芽胞杆菌可分为4大类群（图1）。第I类群为枯草芽胞杆菌类群，包含21株菌15个种。其中3株菌可能为芽胞杆菌属的潜在新种，FJAT-25496与其最相近匹配模式菌株Bacillus oceanisediminisH2T的16S rRNA基因相似为97.6%，FJAT-25547与其最相近匹配模式菌株Bacillushorneckiae的16S rRNA基因相似为97.7%，FJAT-25550与其最相近匹配模式菌株Bacillus mesophilum的16S rRNA基因相似为98.1%。第II类群主要为蜡样芽胞杆菌类群和1株Fictibacillus barbaricusFJAT-25574，其中FJAT-25509为潜在新种，与其最匹配模式菌株的16S rRNA基因相似为97.0%。第III类群为类芽胞杆菌科，包含类芽胞杆菌属和短芽胞杆菌属2个属，其中类芽胞杆菌的7个种和短芽胞杆菌2个种。第IV类群主要为赖氨酸芽胞杆菌属及1株Rummeliibacillus pycnusFJAT-25531和1株Psychrobacillus psychroduransFJAT-25571。其中，潜在新种FJAT-25531与其最相近匹配模式菌株Lysinibacillus macroides的16S rRNA基因相似为92.0%，FJAT-25571与其最相近匹配模式菌株Psychrobacillus psychrodurans的16S rRNA基因相似为98.6%。

2.3 农林生态区芽胞杆菌的分布

Shannon指数多样性分析得出，土壤芽胞杆菌Shannon指数大小依次为乐山林地＞盐亭县农地＞重庆林地＞盐亭县林地，均匀度指数依次为盐亭县林地＞乐山林地＞重庆林地＞盐亭县农地（表3）。

以芽胞杆菌种类为样本，以芽胞杆菌种类含量为指标，当欧式距离λ=15时，可分为两大类群（图2）。第I类群为高含量广分布型，包含7个种，分布在3-4个采集点，分别是韦氏芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、嗜冷芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、阿氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、奇异虚构芽胞杆菌和图瓦永芽胞杆菌，此群主要特征为芽胞杆菌种类或含量很高，或者分布广，其中图瓦永芽胞杆菌和解木糖赖氨酸芽胞杆菌在所有采集点均有分离到；第II类群特征含量低分布不均匀型，仅分布在一个或2个地点，包含除第一群种类的所有芽胞杆菌种类。

2.4 林地生态区芽胞杆菌资源分布比较

林地生境类型土壤中芽胞杆菌资源种类具有不同的分布特征。盐亭县林地中芽胞杆菌菌落含量最高，达1.99×105CFU/g，而忠县林地的最少，仅为3.07×103CFU/g。多样性指数分析表明，不同地理分布林地的香农指数相近，乐山林地的最高，而盐亭县林地的最低。盐亭县林地土壤中的优势种群主要为简单芽胞杆菌，乐山林地的为短短芽胞杆菌，忠县林地的为解木糖赖氨酸芽胞杆菌。

表2 农林生态区土壤芽胞杆菌的16S rRNA基因鉴定

图1 基于16S rRNA基因的农林生态区土壤芽胞杆菌系统发育分析

表3 农林生态区土壤中芽胞杆菌多样性指数

图2 农林生态区土壤芽胞杆菌种类含量聚类分析

2.5 林地和农地芽胞杆菌资源多样性比较

不同生境类型土壤中的芽胞杆菌资源含量和种群结构差异较大，农地中的芽胞杆菌含量明显高于林地，农地的菌落含量平均为1.95×105CFU/g，林地的为0.80×105CFU/g。农地生境类型的芽胞杆菌优势种群为韦氏芽胞杆菌，但在林地中未分离获得此种群。林地的优势种简单芽胞杆菌和短短芽胞杆菌亦未在农地中获得。

3 讨论

土壤是微生物生存的大本营，不同生态系统环境中，土壤中芽胞杆菌种类资源种群分布具有一定的差异。葛慈斌等［18］利用可培养方法了解了武夷山自然保护区芽胞杆菌分布状况，芽胞杆菌属为优势属，其次为类芽胞杆菌属和赖氨酸芽胞杆菌属。龚国淑等［19］通过可培养法从成都市郊区表层土样共分离到芽胞杆菌21个种，环状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌为优势种群。胡桦等［9］分析四川和重庆紫色土中硅酸盐细菌多样性，主要为胶胨样芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus），还首次发现硅酸盐细菌分布在蜡样芽胞杆菌中。东寨港红树林土壤中含有大量的芽胞杆菌，存在较为丰富的遗传多样性，通过热处理法分离获得芽胞杆菌6个属的种类［20］。宋敏等［21］调查了永兴岛土壤中芽胞杆菌资源发现，该生境中优势种群为芽胞杆菌属和赖氨酸芽胞杆菌属。吕刚［22］调查了河南省土壤芽胞杆菌多样性，获得了芽胞杆菌5个属即芽胞杆菌属、赖氨酸芽胞杆菌属、鸟氨酸芽胞杆菌属（Ornithinibacillus）、短芽胞杆菌属和类芽胞杆菌属。优势种是巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）和简单芽胞杆菌（Bacillus simplex）。上述研究结果表明，土壤中含有丰富的芽胞杆菌资源，芽胞杆菌属为主要优势种，不同生境类型下芽胞杆菌的种群组成具有一定的差异。

本研究从四川和重庆采集的土壤样本中共分离获得芽胞杆菌7个属的38个种，芽胞杆菌属为所有生境中的优势属，优势种为图瓦永芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、短短芽胞杆菌和解木糖赖氨酸芽胞杆菌，这与上述研究中优势种群不一致。本研究中的芽胞杆菌属和赖氨酸芽胞杆菌属为不同生境的共有属，这与永兴岛土壤的研究结果基本一致；而短芽胞杆菌属、嗜冷芽胞杆菌属、鲁梅尔芽胞杆菌属和虚构芽胞杆菌属4个属仅在1个样本出现，为本研究的特有属。本研究未获得河南省土壤中发现的Ornithinibacillus，而嗜冷芽胞杆菌属、鲁梅尔芽胞杆菌属和虚构芽胞杆菌属亦未在河南省土壤中发现，这可能与土壤类型和地理位置有一定关系。本研究结果表明农林生态区土壤样本中芽胞杆菌的菌落数量为3.07×103-1.99×105CFU/g干土，与龚国淑等［19］调查的成都郊区土壤中的芽胞杆菌数量（4.30×103-8.53×105CFU/g干土）具有一致性。

根据国际细菌种的定义标准，当未知菌株与其最相近模式菌株间的16S相似性低于98.65%时，未知菌株可能为新种［23］。本研究从四川和重庆农林生态区土壤中发现6株芽胞杆菌与其相近菌的16S相似性低于种的界限阈值，为芽胞杆菌潜在新种。其中1株已在IJSEM正式发表［11］，另外5株需要多相分类指标进一步验证确定其准确的分类地位。

芽胞杆菌多样性指数分析表明，乐山林地芽胞杆菌的Shannon指数最高，而盐亭县林地的最低。同种芽胞杆菌在不同的环境条件下分布不同，如解木糖赖氨酸芽胞杆菌在所有样本均存在，短短芽胞杆菌仅在乐山林地土壤中获得且为其优势种。骆婷等［24］调查发现森林土壤中较高的可培养细菌多样性，并筛选获得了具有多功能降解作用的类芽胞杆菌。不同区域间的物种存在着差异性，其优势种也具有一定的差异，如盐亭县农地生境类型的优势芽胞杆菌种群为韦氏芽胞杆菌，盐亭县林地的优势种群为简单芽胞杆菌。本研究表明农林生态区土壤中蕴藏着丰富的芽胞杆菌资源，且含有一定的新资源，为芽胞杆菌新资源挖掘和功能菌株开发提供了保障。

4 结语

从四川省和重庆市农林生态区采集的5份土壤样品中分离获得芽胞杆菌95株，去重复后选取57株，通过细菌通用引物16S rRNA基因进行扩增、测序、比对，鉴定57株菌为芽胞杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽胞杆菌属（Lysinbacillus）、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）、嗜冷芽胞杆菌属（Psychrobacillus）、鲁梅尔芽胞杆菌属（Rummeliibacillus）和虚构芽胞杆菌属（Fictibacillus），其中优势属为芽胞杆菌属。根据细菌种的界定阈值16S rRNA小于98.65%，发现6株分离菌为潜在芽胞杆菌新种。芽胞杆菌种类可分为高含量分布广型和低含量分布不均匀型，农林生态区土壤芽胞杆菌多样性指数依次为乐山林地＞ 盐亭县农地＞ 重庆。