袁广富 ， 肖 娜 ， 张增贤 ， 刘 莹 ， 左玉柱 ， 范京惠

(1.河北农业大学动物医学院 ， 河北 保定 071001 ; 2.河北省定州市动物防疫监督总站 ， 河北 定州 073000 ;3.河北省宁晋县畜牧兽医管理办公室 , 河北 宁晋 055550)

牛巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种败血性传染病，又称牛出血性败血症。牛巴氏杆菌最早发现于1881年，被认为与多种野生动物和家养动物疾病相关[1]，牛巴氏杆菌分为5个荚膜型(A,B,D,E,F)和16个血清型(1～16)[2]。2010-2011年重庆市多个牛场发生牛巴氏杆菌感染致死病例[3]。2010-2012年在吉林省规模化牛养殖场的病牛中发现了牛巴氏杆菌的感染[4]。

本试验根据采集死亡牛的肝脏、肾脏、脾脏，经过菌落形态观察、培养特性，进行病原菌的分离纯化及PCR鉴定，并对鉴定的病原菌进行药物敏感性分析，以确诊该牛场牛群发病原因，挽救患牛生命，保障牛场的经济不受损失，为减少疫病的发生提出防治措施。

1 材料与方法

1.1 病料 河北省衡水市某奶牛场无菌采集发病死亡奶牛的肝脏、肾脏、脾脏送至河北农业大学动物医学院预防兽医实验室检测。

1.2 培养基、试剂及仪器 血清琼脂平板培养基、LB液体培养基，由河北农业大学动物医学院预防兽医实验室配制；革兰染色液，购自潍坊市康华生物技术有限公司；胶回收试剂盒、DL-2 000 DNA Marker(MD114)，购自宝日医生物技术(北京)有限公司；光学显微镜，购自尼康(Nikon)公司；2×TaqPCR Mix，购自中科瑞泰生物科技有限公司；BIOWEST琼脂糖，购自上海玉博生物技术有限公司；Neofuge 13R高速冷冻离心机，购自上海力申科学仪器有限公司；PCR扩增仪，购自深圳市宇德立生物科技有限公司；DYY-8C电泳仪，购自北京市六一仪器厂；Protein simple凝胶成像系统，购自普诺森生物科技(上海)有限公司；HWS智能型恒温恒湿培养箱，购自宁波江南仪器厂。

1.3 临床症状观察及剖检记录 通过对牛场工作人员的询问记录该牛场患牛的临床症状；对患病死亡牛进行剖检，观察患病牛组织病理变化并记录。

1.4 病原菌的分离与培养 无菌采集死亡牛肝脏、肾脏、脾脏的病健交界处剪取一小块组织样本，同时无菌接种于血清琼脂平板培养基、麦康凯琼脂培养基、血液琼脂培养基和普通琼脂培养基后，置于37 ℃恒温培养箱过夜，进行细菌分离培养。用接种环挑取一单菌落涂于载玻片上，按照革兰染色液的说明书进行革兰染色并镜检，在光学显微镜下观察菌落形态，对分离菌进行初步鉴定。再挑取一单菌落，将单菌落接种至LB-血清液体培养基中，37 ℃振摇培养20 h，备用。

1.5 PCR鉴定

1.5.1 引物设计与合成 利用Primer 5.0 引物设计的软件，根据GenBank上细菌的基因序列进行同源性多重比对并获得其保守区设计一对通用PCR引物，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成(见表1)。

表1 通用引物信息

1.5.3 琼脂糖凝胶回收 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段，在UV透射仪下，将目的片段从胶上切下放入离心管中，加入1倍体积的Buffer GC,60 ℃水浴10 min至胶融化。根据宝日医生物技术(北京)有限公司的胶回收试剂盒说明书进行目的片段回收纯化，最终获得的胶回收产物。

1.5.4 PCR扩增序列分析 将最终获得的胶回收产物送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行测序，测序结果在NCBI进行同源性比较。

1.6 药敏试验 在无菌操作台中吸取已鉴定后培养的菌液50L，分别转移至3个血清琼脂培养基中并均匀涂开，用镊子夹取21种药敏纸片，每个血清琼脂培养基表面按压7种药敏纸片，并做好标记，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺量取抑菌环直径，参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)动物源细菌药敏试验标准，分别以敏感、中介和耐药3种形式对药物敏感性进行分析。

2 结果

2.1 临床症状观察及剖检记录 患病牛发病初期体温升高，达到41.3～42.5 ℃，心跳加快，皮温不整，精神不振，食欲减退或废绝，气喘流涎，鼻镜干裂，被毛粗乱，病牛会出现腹痛，偶尔会出现空嚼症状，严重时病牛出现呼吸困难，呼吸频率加快，全身衰弱，倒地俯卧。对患病牛进行剖检可见，皮下组织及肌肉均有出血点，脾脏有点状出血，但不肿胀；肝脏和肾脏有实质性变性；胸腔内有大量纤维素性渗出物存在；淋巴结肿大、出血。

2.2 病原分离培养 病料接种至血清琼脂培养基上生长良好，经过16 h后生长为光滑、湿润的圆形菌落；病料接种至麦康凯琼脂培养基上不生长细菌；病料接种至血液琼脂培养基上生长像露珠一样的小菌落，无溶血现象；病料接种至普通琼脂培养基上生长贫瘠，生长状况较差。挑取生长良好的单一菌落，经过革兰染色镜检为革兰阴性短杆菌。

2.3 PCR鉴定结果 经过PCR扩增，结果显示，扩增出现的目的条带与预期目的条带大小一致(见图1)；将牛巴氏杆菌的阳性扩增产物送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行测序，将16S rDNA测序结果在NCBI上进行BLAST分析，与牛巴氏杆菌基因序列的同源性达99%，进一步确定送检患病牛感染巴氏杆菌。将测序结果与GenBank中公布的JQ404475、JQ726501、JQ975927、JQ975948、JX975443、JX975446相应的16S rDNA序列进行比较，其同源性在98%～100%之间(见图2、图3)。

图1 牛巴氏杆菌PCR扩增
M:DNA分子质量标准 ; 1-3：牛巴氏杆菌的PCR扩增产物

图2 牛巴氏杆菌16S rDNA基因同源性

图3 牛巴氏杆菌16S rDNA基因进化树

2.4 耐药性分析结果 本研究选择21种药敏片参考CLSI动物源细菌药敏试验标准，分别以敏感、中介和耐药3种形式对已分离鉴定的病原菌进行耐药性分析，分析结果见表2，从患病牛分离的巴氏杆菌对林可霉素、庆大霉素等13种抗生素不同程度耐药；对头孢噻肟、头孢唑林、米诺环素、恩诺沙星、氨苄西林、氟苯尼考敏感。见表2。

表2 牛巴氏杆菌耐药性分析结果 (mm)

3 讨论

牛巴氏杆菌病是由于感染巴氏杆菌而引起的传染病，又称出血性败血症[5]，往往出现突然发病，有较高的死亡率。随着养牛业的不断发展，牛巴氏杆菌病对牛场造成极大的经济损失，严重影响养殖户的经济效益[6]。

该牛场患病牛出现体温升高，精神不振，反刍次数减少，反应迟钝，呼吸困难，眼结膜潮红等临床症状，部分患病牛衰竭死亡，剖检可见严重的肌肉及内脏出血。初步认定为牛巴氏杆菌感染，为对患病牛进行确诊，将无菌采集发病死亡牛的肝脏、肾脏、脾脏进行一系列的检测为阳性，并将阳性产物送至测序公司进行测序，与牛巴氏杆菌基因序列具有高度同源性，确诊为牛巴氏杆菌病。

牛巴氏杆菌是一种短小、两端钝圆的球杆状或短杆菌，多呈散在、无运动性，不形成芽孢，革兰阴性，两极浓染，又叫两极杆菌至麦康凯琼脂培养基上不生长细菌；至血液琼脂培养基上生长像露珠一样的小菌落，无溶血现象；至普通琼脂培养基上生长贫瘠，生长状况较差；至血清琼脂培养基上生长良好，经过16 h后生长为光滑湿润的圆形菌落[7]，并且与很多细菌的形态相似，但在生化反应上有所区别。

在本试验中，牛巴氏杆菌对头孢噻肟、头孢唑林、米诺环素、恩诺沙星、氨苄西林、氟苯尼考敏感；而对环丙沙星、林可霉素等13种抗生素耐药。通常情况下，临床上治疗牛巴氏杆菌病的抗菌药物有环丙沙星、洛美沙星、红霉素和阿奇霉素等[8],由于抗生素的长期不合理、不适量使用，导致牛巴氏杆菌对临床多种抗生素都有不同程度的耐药，并且菌株的耐药性还在不断增强[9]。2015年俸忠兰等[7]对牛巴氏杆菌的耐药性分析结果和2016年刘顺磊等[10]对牛巴氏杆菌的耐药性检测都已经反映出由于超量的不适当使用，牛巴氏杆菌的耐药程度越来越严重，并且严重影响了药物的治疗效果和养牛业的经济效益[11-14]。

预防本病的关键在于平时注意改善舍内的通风和饲养管理，避免通风不良，实时监测牛群的健康状况，按时进行疫苗接种，本病对该牛场造成极大的经济损失，本试验为确诊该牛场牛群发病原因并提出恰当的防治措施，建议选择敏感药物进行用药，加强饲养管理,保障养牛业的健康快速发展。