陈昕钰，陈铭鑫，杨 阳，李 波,2，董召娣，汪巧菊，余徐润，熊 飞

(1.扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009； 2.江苏沿江地区农业科学研究所，江苏南通 226541)

干旱是小麦生产中常遇到的自然灾害之一，它通过影响植株形态结构、生理生化及基因调控，最终影响产量和品质[1]。小麦在营养生长和生殖生长过程中都极易受干旱胁迫的影响，其中开花期和灌浆期干旱对小麦产量的影响最大[2]。胚乳是颖果的主要组织结构，淀粉和蛋白质作为主要储藏物质，分别以淀粉体和蛋白体的形式积累于胚乳细胞[3]。胚乳细胞的分裂、发育以及其中淀粉和蛋白质的充实度，直接决定小麦的产量和品质[4]。前人观察了干旱胁迫下小麦颖果组织的结构特征，并研究了干旱对胚乳淀粉和蛋白质积累的影响[5-6]。Singh等[7]研究发现干旱胁迫会降低小麦B-型淀粉粒的比例和直链淀粉的含量。Zhang等[8]指出干旱胁迫下小麦颖果中醇溶蛋白和清蛋白含量有所增加。

植物激素是由自身代谢合成的一类有机分子，在植物生长发育和响应逆境胁迫中发挥着重要的调控作用[9]。干旱胁迫下植物内源激素的含量和活性发生改变，从而调控生理生化过程以及同化产物的运输分配以适应干旱[10]。有研究表明，为响应干旱胁迫，植物中脱落酸(ABA)和细胞分裂素(CTK)含量会发生变化，其中ABA的浓度在植物叶片、花器官和发育的籽粒中均显著增加[11-12]。张 炜等[13]研究不同激素间的协同调控作用，发现干旱胁迫下小麦幼苗的根、叶片和叶鞘中的ABA、生长素(IAA)的含量均有所增加，二者协同调控气孔关闭和根系生长。

前人关于干旱胁迫对小麦激素影响的研究较多。Lu等[14]认为干旱条件下抗旱小麦叶片中能积累更多的ABA；Guoth等[15]观察发现，发生渗透胁迫时干旱敏感型小麦根部的ABA含量较高；Westgate等[16]发现干旱条件下小麦花器官中的ABA含量可增加10～15倍。前人的这些研究主要集中在小麦根、叶以及花器官上，然而有关干旱胁迫下小麦颖果内源激素含量变化的研究鲜有报道，关于干旱胁迫下颖果激素变化与胚乳细胞发育的关系尚不清楚。因此，本研究以小麦品种扬麦16为材料，在幼苗返青至颖果成熟阶段进行干旱处理，采集不同发育时期的小麦颖果，采用树脂切片及显微观察等技术，从显微水平观察干旱胁迫下小麦胚乳细胞发育的结构特征；同时，采用酶联免疫吸附法测定激素含量，研究干旱胁迫下小麦颖果内源激素的变化规律及其与胚乳细胞发育的关系，以期为明确干旱诱导激素调控的颖果发育机制及小麦产量和品质提升提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及处理

试验于2015年10月至2016年5月在扬州大学江苏省作物栽培重点实验室试验棚内进行。供试小麦品种为扬麦16，由扬州大学农学院提供。采用盆栽方式进行。土壤为砂壤土，基肥含有机质24.5 g·kg-1，速效氮106 mg·kg-1，有机磷33.8 mg·kg-1，速效钾66.4 mg·kg-1。10月29日播种， 每盆播种20粒，2周后间苗，每盆保留8株。在小麦花期用记号笔标记开花的颖壳并给植株挂牌以确定开花日期，标记的颖花均为穗中部小穗基部的2朵小花。

干旱处理方式为全生育时期干旱，即从幼苗返青期开始到颖果成熟的整个生育阶段内严格控制浇水量，并采用负压式水势计(SP-11,ISSCAS,China)检测距地表15 cm的土壤水势，使正常水分组和干旱胁迫组的土壤水势分别维持在-20 kPa和-60 kPa左右。每处理30盆，整个生育过程中2个处理组的施肥、除草及防虫害等管理措施均一致。

1.2 颖果千粒重、可溶性糖含量、总淀粉含量以及蛋白质含量的测定

采集成熟小麦籽粒，测定新鲜颖果的千粒重，然后将其置于鼓风干燥箱，105 ℃杀青1 h，42 ℃烘至恒重。将干燥的小麦籽粒研磨成粉末，过100目金属网筛，备用。称取200 mg粉末，采用蒽酮比色法[17]测定可溶性糖和总淀粉含量，采用凯氏定氮法[17]测定蛋白质含量。

1.3 颖果组织化学染色及体视显微镜观察

选取不同发育天数的颖果，在体视显微镜(MZ6,Leica,Germany)下观察颖果的形态并拍照。同时，将颖果从中间部位横切，用I2/KI(0.3% I2+1% KI)染液染色30 s后于体视显微镜下拍照。

1.4 颖果组织树脂切片观察

采集不同发育时期的颖果，用洁净的剃须刀片横向切取颖果中部2 mm厚的片段并迅速置于2.5%戊二醛溶液固定48 h。样品经磷酸缓冲液漂洗后再经梯度乙醇脱水、环氧丙烷置换、Spurr低黏度树脂浸透与包埋，70 ℃聚合12 h。将聚合后的样品用玻璃刀在超薄切片机(Ultracut R,Leica,Germany)上切1 μm的半薄切片，0.5%甲基紫溶液染色，再通过装有CCD相机的光学显微镜(DMLS,Leica,Germany)观察并拍照。每处理选取3个颖果作为重复，各颖果均来自不同麦穗。

1.5 胚乳及其充实物质数量特征统计

按照Chen等[18]的方法，通过Photoshop软件(Version CS6,Adobe,USA)处理拍摄的显微图像，用Image-Pro Plus图像分析软件(Version 6.0,Media Cybernetics,USA)统计胚乳细胞数目、胚乳横截面积以及胚乳细胞中淀粉体和蛋白体的相对面积。

1.6 颖果内源激素含量测定

采用酶联免疫吸附法[19]测定小麦颖果中生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3、GA4)、玉米素核苷(ZR)和二氢玉米素核苷(DHZR)的含量。

1.7 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 19.0软件统计分析数据，用t测验进行显著性分析；采用Photoshop和Origin 9.1软件制图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下小麦颖果的生长发育

正常水分下，小麦颖果在发育前期形态变化较大，颖果子房不断纵向膨胀生长，在花后11 d时几乎达到最大值，在该阶段，颖果表面呈乳白色；随后，颖果横向加宽生长，表面颜色逐渐变绿；到了花后23～32 d，颖果基本成型，无明显形态变化，表面颜色逐渐变黄；花后35 d，颖果成熟，脱水变硬。另外，从颖果横切的I2/KI染色结果可以看出，在花后5 d前，果皮被染成黑色而胚乳组织几乎未被染色；之后，随颖果发育，胚乳逐渐被染成黑色并不断加深，而果皮逐渐变薄，I2/KI染色后的颜色逐渐慢慢消失(图1A)。说明在颖果发育过程中胚乳淀粉的积累量不断增加，而果皮淀粉逐渐降解。遭受干旱胁迫后，颖果的形态发育过程与正常水分下基本一致，但干旱会加快颖果的发育进程，促进颖果提前成熟；花后29 d后，颖果发育成熟，成熟时间早于正常水分下发育同时期的颖果；同时，随着干旱胁迫时间的持续，在发育后期，干旱胁迫下的小麦颖果体积明显变小，成熟颖果表面皱缩，发育不良(图1B)。另外，干旱胁迫下颖果横切的I2/KI染色结果与正常水分处理间无明显差别。

A:正常水分下小麦颖果形态发育和横切面I2/KI染色；B:干旱胁迫下小麦颖果形态发育和横切面I2/KI染色。图下方的数字为颖果发育天数。

分析成熟小麦颖果千粒重以及可溶性糖、总淀粉和蛋白质含量，发现干旱胁迫下成熟小麦颖果的千粒重为46.69 g，较正常水分处理低20.00%，差异显著(P<0.05)；同时，其可溶性糖含量和总淀粉含量分别较正常水分处理低35.29%和2.80%，而蛋白质含量较正常水分处理高8.40%，说明干旱胁迫在降低小麦颖果质量的同时还能显著影响主要储藏物质(糖类和蛋白)的积累。

2.2 干旱胁迫下胚乳细胞结构的发育

小麦胚乳的发育过程主要包括胚乳细胞的分裂、生长以及胚乳细胞中淀粉和蛋白的充实。在花后5 d，胚乳细胞仍具有分裂能力，细胞核明显且细胞中已经积累了少量的小淀粉体。干旱胁迫下，小麦胚乳中存在更多的细胞核和淀粉体，细胞分裂旺盛(图2A和图2C)，且其胚乳细胞数目以及胚乳面积也显著多于或高于正常水分处理(图3A和图3B)。说明，干旱胁迫能促进颖果发育早期胚乳细胞的分裂和生长。

花后10 d，胚乳淀粉的积累量增多，体积变大，正常水分和干旱胁迫的小麦胚乳细胞中积累了小蛋白体，且两者的蛋白体相对面积无显著差异，但遭受干旱胁迫的小麦胚乳细胞中淀粉体的数量较多，淀粉体相对面积显著大于正常水分处理(图2B和图2D；图3C和图3D)。另外，干旱胁迫下的小麦胚乳数目和胚乳面积均显著少于或小于正常水分处理(图3A和图3B)，说明，随干旱时间持续，胚乳细胞的进一步分裂和扩张受到抑制，同时也影响了淀粉的充实。

花后15 d，胚乳细胞的分裂和胚乳细胞化基本完成，细胞数目稳定，颖果灌浆达到高峰，胚乳淀粉进一步充实，并且在胚乳细胞中积累了蛋白体。正常水分和干旱胁迫下小麦的胚乳细胞数目无显著差异，但干旱胁迫下小麦的胚乳面积显著小于正常水分处理(图3A和图3B)，说明干旱胁迫能阻碍胚乳细胞的扩张生长。同时，正常水分下小麦胚乳淀粉的充实度优于干旱胁迫，干旱胁迫下胚乳细胞中淀粉体的数量较少，淀粉体相对面积显著小于正常水分处理(图2E、图2H和图3C)。但与正常水分处理相比，干旱胁迫下小麦胚乳细胞中积累的蛋白体数量较多，尺寸大，蛋白体的相对面积也较大(图2E、图2H和图3D)。

花后20 d，正常水分下小麦的胚乳细胞基本被淀粉体充实，蛋白体游离分布于淀粉体间隙中。而干旱胁迫下小麦的胚乳细胞未完全充实，在淀粉体间存在较大的空隙，积累了一些大的蛋白体(图2F,图2I)。与正常水分处理相比，干旱胁迫下胚乳细胞中淀粉体的相对面积无显著变化，但蛋白体的相对面积显著增加(图3C和图3D)。

花后25 d，胚乳细胞完全被充满，并且淀粉体相互挤压变形，蛋白体体积增大，充实于淀粉体间隙。干旱胁迫下小麦胚乳细胞中蛋白体的积累量增加，蛋白体的相对面积显著大于正常水分处理，并且一些小的蛋白体聚集在一起，形成了较大的蛋白体(图2G、图2J)。

以上结果表明，在颖果发育早期，干旱胁迫能促进胚乳细胞的分裂和生长，加速胚乳发育。但随干旱时间持续，胚乳细胞的进一步扩张受到抑制。同时，干旱胁迫阻碍了胚乳细胞中淀粉体的充实，但提高了蛋白体的积累量。

2.3 干旱胁迫下颖果内源激素含量的变化

由图4A可知，小麦颖果从花后发育至灌浆成熟阶段IAA含量的变化呈单峰曲线。从花后5 d开始，IAA含量持续升高，到花后25 d达到最大值，之后随颖果成熟其IAA含量快速下降。在颖果发育前期，干旱胁迫下小麦颖果的IAA含量显著高于正常水分处理，且花后15 d时两者差距达到最大(为11.42%)，但花后25 d后，其IAA含量显著低于正常水分处理。说明干旱胁迫能提高小麦发育前期颖果的IAA含量，促进颖果的前期发育。

无论是干旱胁迫还是和正常水分处理，小麦颖果的ABA含量均呈先升后降的变化趋势(图4B)。在颖果发育早期ABA含量快速增加，在花后10 d达到最大值，之后随灌浆持续和籽粒成熟而逐渐降低。花后5 d，干旱胁迫处理下小麦颖果的ABA含量较正常水分处理提高了40.15%，且在之后整个颖果的发育过程中，其ABA含量一直显著高于正常水分处理。表明干旱胁迫能提高颖果中ABA的积累，从而发挥ABA的生理作用，调控小麦对干旱的响应。

A、B、E、F、G分别为正常水分下小麦颖果花后5、10、15、20、25 d的胚乳结构；C、D、H、I、J分别为干旱胁迫下小麦颖果花后5、10、15、20、25 d的胚乳结构；Nu：细胞核；SG：淀粉体；PB：蛋白体。

随小麦颖果发育，GA3含量逐渐下降，GA4含量则呈先升后降的变化趋势，且于花后20 d时达到最大值(图4C和图4D)。在发育早期，干旱胁迫下小麦颖果的GA3含量略高于正常水分处理，花后15 d之后略低于正常水分处理，但两者间的差异始终未达到显著水平。而干旱胁迫下小麦颖果的GA4含量在花后15 d之前显著高于正常水分处理，随后则显著降低。

小麦颖果的ZR含量随发育过程推进呈先升后降的变化趋势，在发育早期，干旱胁迫下颖果的ZR含量显著高于正常水分处理，且在花后5 d时较正常水分处理高13.23%；花后15～25 d，干旱胁迫下小麦颖果的ZR含量显著低于正常水分处理(图4E)。

DHZR含量随小麦颖果发育呈逐渐下降的变化趋势，花后5 d，小麦颖果的DHZR含量最高，且干旱胁迫下颖果的DHZR含量较正常水分处理高5.14%(P<0.05)；之后，随颖果发育，DHZR含量逐渐下降，在花后15～20 d，干旱胁迫颖果中的DHZR含量显著低于正常水分处理(图4F)。

综上所述，在颖果发育过程中各类激素的变化规律各不相同，并且对干旱胁迫的响应也不一致。干旱胁迫下，小麦颖果的IAA、GA3、GA4、ZR和DHZR含量在发育前期均高于正常水分处理，发育后期则低于后者。但在颖果整个发育过程中，干旱胁迫下小麦颖果ABA含量始终高于正常水分处理。

3 讨 论

内源性激素作为植物逆境胁迫的响应因子，在应对干旱胁迫时发挥重要作用。植物在干旱胁迫下会引起自身内源激素含量和活性的改变，从而调控植物的生理生化过程以及同化产物的运输和分配[10]。ABA作为主要的内源性激素之一，在植物的抗逆生长，尤其是在水分胁迫下具有重要的调控作用，甚至被认为是衡量作物抗旱性的潜在指标。ABA参与调控植物生长发育中的各种生理过程，包括气孔开闭、种子发育、胚胎形态建成以及蛋白等储藏物质的合成[20]。普遍认为，干旱胁迫能够显著提高ABA含量，在导致生理变化的同时调控多种胁迫应答基因的表达，如LEA蛋白、脱水蛋白、扩展蛋白等胁迫应答蛋白[21]。研究表明，小麦在遭受干旱胁迫时，首先在根部快速合成ABA，之后通过木质部和韧皮部运输至各营养器官和生殖组织，导致颖果中ABA含量升高，并通过调控细胞分裂、碳代谢酶活性等相关基因的表达，影响颖果的生长发育[22]。本研究中，干旱胁迫提高了颖果整个发育过程中的ABA含量，且干旱胁迫能促进颖果的早期发育，抑制后期发育，这可能是由干旱诱导的颖果中高含量ABA调控不同的生理过程造成的。在颖果发育早期，ABA含量升高诱导扩展蛋白表达上调，扩展蛋白活性提高，促进细胞的伸长生长[23]，因此颖果发育加快，导致胚乳面积增加。随颖果的发育，干旱诱导的高ABA含量主要从3个方面影响颖果生长：首先，ABA能通过抑制细胞周期相关基因的表达阻碍胚乳细胞的分裂[24]；其次，ABA能诱导气孔关闭，降低光合作用，减少碳水化合物的供应比率，进而导致颖果储藏物质积累的下降[25]；再者，ABA能通过影响碳水化合物催化酶活性扰乱颖果中的碳代谢[26]。总之，不论是在颖果发育的早期还是后期，ABA调控颖果发育对干旱胁迫响应的最终目标是达到保证自身存活和生产力的最佳平衡。

*表示干旱胁迫处理与对照之间在0.05水平下差异显著。下图同。

图4 干旱胁迫下小麦颖果中内源激素含量的变化

小麦颖果发育受内源激素的调控，籽粒的形态建成以及灌浆充实过程均有内源激素的参与[27]。诸多研究认为，IAA和GAs与同化物的调运密切相关，参与调控了同化物质在籽粒库中的积累和转化[28]。闫 洁等[29]研究认为，较高的IAA含量有利于光合产物向籽粒转运，加快灌浆速率。Pharis和King[30]的研究指出，GAs的生化合成及含量的动态变化与颖果的发育进程一致。本研究中，在颖果发育前期，干旱胁迫诱导IAA和GA4的积累，加快发育进程，表现出胚乳淀粉积累的增加。而到发育后期，干旱胁迫抑制颖果中IAA和GA4的积累，从而阻碍了同化物向颖果的转运，这与干旱胁迫下胚乳细胞淀粉充实度不佳的结果一致。前人研究表明，较高的GA3含量会增强α-淀粉酶等水解酶活性[31]，而本研究中，随颖果发育其GA3含量逐渐下降，且干旱胁迫提高了颖果发育早期的GA3含量。这可能是因为在颖果早期发育中果皮发育占主导，而干旱诱导GA3含量的增加促进了果皮淀粉的降解，这与前人的研究结果一致[5]。本研究还发现，干旱胁迫可促进颖果的ABA的积累，而ABA可以加速籽粒成熟并促进贮藏蛋白的积累。

ZR和DHZR是小麦等高等植物体内主要的游离态细胞分裂素，能促进细胞的分裂和生长。研究表明，禾谷类胚乳细胞的分裂和扩大与籽粒细胞分裂素的积累有关[32]。本研究中，干旱胁迫下颖果中的ZR和DHZR含量在发育早期升高，而发育后期，两者含量均低于正常水分处理。另外，干旱胁迫下，发育早期颖果的胚乳细胞数目多，胚乳面积大，表明干旱能诱导颖果中ZR和DHZR含量的增加，促进胚乳细胞的分裂和生长。总的来说，干旱胁迫会影响小麦颖果中各类激素的积累，而这些激素间相互协调，共同调控胚乳细胞发育和充实，使得颖果生长适应干旱。