吴龙 刘晨 蒋宏传

[摘要] 目的 利用miRNA芯片研究乳腺癌術后并发卵巢癌患者中差异表达的microRNAs及其相关性，为乳腺癌术后并发卵巢癌的早期预测提供理论依据。 方法 选择2000年1月～2014年12月于首都医科大学附属北京朝阳医院就诊的乳腺癌患者为研究对象，以乳腺癌术后并发卵巢癌者为实验组，并以乳腺癌术后并发妇科良性疾患者（良性对照组）和乳腺癌术后无妇科疾患者（单发乳腺癌对照组）为对照，采用miRNA芯片和qRT-PCR技术，筛选并分析各组间差异表达的miRNAs。 结果 miRNA芯片检测得到系列差异表达的miRNAs，其中miR-1234差异表达最显著，利用qRT-PCR对miR-1234表达量进行验证的结果也显示，实验组中miR-1234表达水平显著高于良性对照组和单发乳腺癌对照组（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌术后卵巢癌的早期预测的敏感性和特异性均为80%。 结论 miR-1234在乳腺癌术后罹患卵巢癌患者与乳腺癌术后未患卵巢癌患者中表达差异最为明显，有望成为乳腺癌术后并发卵巢癌早期预测的肿瘤标志物。

[关键词] 乳腺-卵巢双原发癌;miR-1234;肿瘤标志物;预防性切除

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（a）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of microRNAs and their correlation in patients with ovarian cancer after breast cancer operation by miRNA microarray， and to provide early prediction of postoperative ovarian cancer. Methods The patients with ovarian cancer who were admitted to Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University from January 2000 to December 2014 were enrolled as research objects. The patients with ovarian cancer after breast cancer surgery were regarded as experimental group， patients with complication of benign gynecological tumors followed by breast cancer （benign control group） and patients with no any abnormal after breast cancer surgery （single breast cancer control group） were regarded as control. The miRNA microarray and qRT-PCR were used to detect the differentially expressed miRNA levels among the groups. Results A series of differentially expressed miRNAs were detected by miRNA microarray， among which miR-1234 was the most significantly differentially expressed， and the results of verification of miR-1234 expression by qRT-PCR also showed that the expression level of miR-1234 in the experimental group was significantly higher than that in the benign control group and the single breast cancer control group （P < 0.05）. The sensitivity and specificity of early prediction of ovarian cancer after breast cancer surgery by using miR-1234 were 80%. Conclusion miR-1234 is the most obvious difference between patients with ovarian cancer after breast cancer surgery and those without ovarian cancer after breast cancer surgery. It is expected to be a tumor marker for early prediction of ovarian cancer after breast cancer operation.

[Key words] Breast-ovarian double primary cancer; miR-1234; Tumor marker; Preventive resection

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤[1]，而卵巢癌是致死率最高的女性生殖道肿瘤[2]。相关研究发现，乳腺癌患者术后卵巢癌的患病率较普通人群明显增高，对乳腺癌患者预防性切除子宫和附件可以避免再次罹患卵巢癌的发生[3-4]。近年来，国内外关于乳腺癌、卵巢癌和乳腺-卵巢双原癌的研究大多集中在基因水平，研究较多的为BRCA1/2基因[5-6]、K-Ras基因[7]、RAD51C基因[8]等，但诸多乳腺癌卵巢癌相关基因，如BRCA1/2，为大型基因，突变位点众多，且中国人群尚无被证实的热点位点，检测花费巨大[9]。另外，虽然基因检测具有较好的预测性，即基因突变阳性时，对乳腺癌或卵巢癌的患病风险值预测较高，但其检出率较低[10-12]。microRNA（miRNA）是一类由约22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，其通过调控人体内相关基因的表达，影响肿瘤的发生发展和预后[13-14]。miRNA在外周血中稳定存在，检出谱系广、灵敏度高、核苷酸序列短、检测成本较低，可作为理想的肿瘤标志物用于肿瘤的早期预测[15-17]。

目前乳腺癌患者术后并发卵巢癌的相关miRNA鲜见报道。本研究旨在寻找可应用于临床的肿瘤标志物，确定乳腺癌术后罹患卵巢癌的高危个体，为其预防性切除提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2000年1月～2014年12月于北京朝阳医院乳腺外科病理确诊并规范治疗的乳腺癌患者为研究对象，根据其随诊情况进行分组。将乳腺癌术后并发卵巢癌者纳入实验组，实验组患者经高年资病理科医师行病理诊断，排除转移性肿瘤情况;按照匹配因素将相匹配的乳腺癌术后未并发妇科恶性肿瘤者纳入对照组，将乳腺癌术后并发妇科良性疾患（子宫内膜息肉、子宫肌瘤等）者纳入良性对照组，将乳腺癌术后无妇科疾患者纳入单发乳腺癌对照组。匹配因素：年龄相近（±5岁），与实验组手术时间相近（±5年）。

1.2 方法

1.2.1 miRNA芯片技术筛选目标miRNA  首先设计并合成一段通用标签，在5′端修饰荧光分子，再依据miRNA文库中的miRNA序列设计相应的探针，探针的5′端是polyA10，中间一段序列与miRNA互补，3′端的一段序列与通用标签互补，探针的5′端进行氨基修饰。同时制备醛基化基片，將探针溶解于点样缓冲液中，点样制备寡核苷酸阵列。将提取好的总RNA与通用标签一并溶解于杂交溶液中，与探针阵列杂交。漂洗除去多余的样品及通用标签，最后采用扫描仪对信号检测并进行分析，判断miRNA的表达谱。

1.2.2 血浆RNA提取与实时荧光定量PCR（qRT-PCR）  按照TRIzol LS试剂盒（北京赛因百奥生物技术公司）说明提取血浆总RNA，并利用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）逆转录获得cDNA，逆转录反应体系包括总RNA 2 μL、人miRNA RT引物或U6 snRNA RE引物1.2 μL、200 U/μL的MMLV逆转录酶0.2 μL、2×Buffer 10 μL，加DEPC水至总体积20 μL;逆转录反应条件为26℃ 30 min，42℃逆转录30 min，85℃酶失活10 min，逆转录产物于-20℃下保存备用。利用Real-Time PCR Master Mix（苏州吉玛基因）进行PCR检测，反应体系包括逆转录产物2 μL、定量PCR Master Mix 10 μL、2.5 U/μL的Taq DNA 聚合酶0.4 μL、20 μmol/L的mRNA正向引物0.8 μL、20 μmol/L的mRNA反向引物0.8 μL，加去离子水至总体积20 μL。所有操作按照厂家提供说明书进行，所用引物序列见表1。反应条件为95℃预变性3 min，然后再95℃变性30 s，62℃退火延伸40 s，循环40次。每个反应重复3次。

1.3 数据分析

采用GenePix 6.0软件、EXCEL软件进行数据统计分析。对于miRNA表达谱结果分析，先对miRNA表达谱数据进行归一化。均一化后的数据进行两种分析，①临床配对比较：组内各样本作为单独个体，根据临床因素进行组间严格配对，进行差异miRNA的筛选，利用配对t检验计算其P值。在5个配对中都差异表达[差异倍数（fold change，FC）>1.5或FC<1/1.5、P < 0.1]的miRNA，作为显著差异表达的miRNA。②组间比较：对各组内同一个miRNA在5个样本中的表达量求平均值，然后三组间再两两比较，进行差异miRNA的筛选，FC>1.5或<1/1.5、P < 0.1的miRNA，作为显著差异表达的miRNA。

1.4 统计学方法

利用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，筛查阶段组间比较FC采用配对t检验;临床配对比较FC与组间比较FC的相关性采用Pearson直线相关分析;验证阶段对三组样品行单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。绘制受试者工作特征（ROC）曲线评价miR-1234用于早期诊断的价值。

2 结果

2.1 患者基本情况分析

本研究共纳入样本量15例，术后病理结果示，乳腺癌术后并发卵巢癌者（实验组）5例，术后并发妇科良性疾患者（良性对照组）5例，乳腺癌术后无妇科疾患者（单发乳腺癌对照组）5例。三组患者年龄及乳腺癌发病年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表2。

2.2 miRNA差异表达谱

在临床配对比较中，a：实验组和良性对照组组间差异表达明显的miRNA有25个;b：实验组和单发乳腺癌对照组组间差异表达明显的miRNA有5个;c：单发乳腺癌对照组和良性对照组组间差异表达明显的miRNA有2个;a和b间共有的差异表达的miRNA有3个;a和c间共有的差异表达明显的miRNA有2个。提示临床配对中差异表达明显的miRNA有25个。见图1。

在组间比较中，a：实验组和良性对照组组间差异表达明显的miRNA有69个;b：实验组和单发乳腺癌对照组组间差异表达明显的miRNA有5个;c：单发乳腺癌对照组和良性对照组组间差异表达明显的miRNA有27个;a和b间共有的差异表达明显的miRNA有4个;a和c间共有的差异表达明显的miRNA有12个;b和c间共有的差异表达明显的miRNA有1个。综上所述，组间比较中差异表达明显的miRNA有57个。见图2。

差异表达明显的11个miRNA均上调表达，其P值均<0.1，其中hsa-miR-3196、hsa-miR-6089、hsa-miR-762、hsa-miR-4271、hsa-miR-2861的P值<0.05。临床配对比较中FC为（16.93±16.74），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-6086、hsa-miR-4447、hsa-miR-4271、hsa-miR-4472，其FC分别为57.70、38.55、17.52、15.80、15.04倍。组间比较统计分析出的FC为（6.75±3.37），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-658、hsa-miR-4447、hsa-miR-92a-2-5p、hsa-miR-4472，其差异表达倍数分别为14.90、8.14、7.56、7.49、7.38倍。见表3。

经直线相关分析，临床配对比较中FC与组间比较FC呈正相关（r = 0.823，P = 0.002），随着临床配对比较中FC的增加，组间比较FC增加。提示根据两种分析方法计算出来的FC虽然不同，但差异趋势一致。

2.3 qRT-PCR结果分析

2.3.1 miR-1234表达分析  对质量检测合格后的qRT-PCR结果进行分析，实验组的miR-1234相对表达量（4.34±2.12）显著高于单发乳腺癌对照组（0.48±0.22）和良性对照组（0.33±0.23），差异有统计学意义（P < 0.05），但良性对照组与单发乳腺癌对照组比较差异无统计学意义（P = 0.69）。见图4。

2.3.2 miR-1234用于早期诊断的价值评价  根据miR-1234在实验组和对照组（包括良性对照组和单发乳腺癌对照组）中的表达量，绘制其ROC曲线，计算曲线下面积，找到最佳cutoff值，计算在此cutoff值下对应的miRA-1234用于乳腺癌术后患者卵巢癌的早期诊断的灵敏度和特異度，miRNA-1234用于乳腺癌术后患者卵巢癌的早期诊断的敏感性和特异性均为80%。见图5。

3 讨论

本研究对miRNA芯片表达谱的分析，为组间比较和临床配对比较两者相结合的方法。既往研究多只应用组间比较的方法，因为其选择的实验组和对照组并未进行配对，有的研究实验组和对照组病例数量也不相匹配[13-14]。而本研究根据患者年龄和乳腺癌手术时间进行了配对比较，再结合组间比较，找出共有的差异表达的miRNAs，提高了差异表达miRNA筛选标准，其结果更有说服力。研究结果显示，miRNA芯片检测得到系列差异表达的miRNAs，其中miR-1234差异表达最显著，利用qRT-PCR对miR-1234表达量进行验证的结果也显示，实验组中miR-1234表达水平显著高于良性对照组和单发乳腺癌对照组（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌术后卵巢癌的早期预测的敏感性和特异性均为80%。

miR-1234作为较新的miRNA，目前在乳腺癌和卵巢癌中研究较少。Kiss等[18]在对唾液腺来源的腺样囊性癌和乳腺来源的腺样囊性癌对比研究中发现，miR-1234仅在乳腺来源的腺样囊性癌中表达，预示着miR-1234可能作为区分唾液腺和乳腺来源的腺样囊性癌的标志。另外，H?gfeldt等[19]在对弥漫性大B细胞淋巴瘤的发病机制研究中发现，miR-1234表达水平与信号转导和转录激活因子3（STAT3）的表达呈负相关，表明STAT3可能是miR-1234的潜在靶标。miR-1234可能参与弥漫性大B细胞淋巴瘤的发生，并与环境背景暴露有关。而既往相关研究均表明，STAT3在卵巢癌中持续性激活，与卵巢癌的发生、发展、转移和侵袭相关[20-22]。这些结果提示，miR-1234可能靶向作用于STAT3，从而参与乳腺癌术后卵巢癌的发生。

本研究通过利用miRNA芯片表达谱检测技术和qRT-PCR研究发现，在乳腺癌术后罹患卵巢癌患者与乳腺癌术后未患卵巢癌患者中存在系列差异性表达miRNA，其中以miR-1234表达差异最为明显，提示其可能在乳腺癌术后并发卵巢癌早期预测中具有重要作用。

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（收稿日期：2018-05-10  本文編辑：张瑜杰）