郝怡宁，初晨露，陈尚兵，陆晨浩，邢常瑞，袁 建

(南京财经大学 食品科学与工程学院,南京 210023)

大豆在我国常被用来制作豆制食品，可用于榨取大豆油、酿造酱油，或用于生产大豆蛋白[1]。大豆是一种极好的蛋白质来源，大豆蛋白质占大豆总质量的30%～50%，新收获的大豆通常90%以上的蛋白质均溶于水，这部分蛋白质被称为水溶性蛋白[2]。大豆水溶性蛋白主要由大豆球蛋白和大豆清蛋白组成，随着大豆新鲜度的降低，大豆中的水溶性蛋白含量逐渐降低。通常来说，水溶性蛋白含量可作为大豆是否适合储存的重要判定指标[3]。

目前，测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、燃烧定氮法、近红外光谱法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、紫外吸收法等，其中测定大豆蛋白含量的主要方法是凯氏定氮法和考马斯亮蓝法。现有测定大豆水溶性蛋白含量的方法主要有NY/T 1205—2005、GB/T 19541—2017 和GB/T 31785—2015。NY/T 1205—2005需要对大豆水溶性蛋白多次提取，步骤较为烦琐。GB/T 19541—2017附录A，用氢氧化钾提取大豆水溶性蛋白的方法虽然过程简单，用时较短，但稳定性较差。GB/T 31785—2015中提取大豆水溶性蛋白的方法，提取率较低。为了简化大豆水溶性蛋白提取的操作步骤，提高大豆水溶性蛋白提取过程中的稳定性，减少实验误差，本文对影响大豆水溶性蛋白的提取因素进行讨论，通过正交实验得到最佳的提取条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆(东北64)：江苏省农科院，于0～4℃储藏。硼酸(H3BO3)，2 g/100 mL；氢氧化钠(NaOH)，40 g/100 mL；硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸。

TDL-5-A型离心机，DKZ系列电热恒温振荡水槽，KX-100型高速多功能粉碎机，电子天平(0.01 g)，电子分析天平(0.1 mg)，电热鼓风干燥箱,BUCHIK-436快速消解仪。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆水溶性蛋白的提取

大豆经粉碎磨成粉，混匀备用。取一定量(精确到0.001 g)样品于50 mL离心管中，加入一定量蒸馏水，使劲摇晃使得试样不结块，均匀分散。将离心管固定于水浴锅在一定温度下振荡提取一定时间。取下离心管，以3 000 r/min离心10 min，将上清液倒入250 mL容量瓶中并定容。

1.2.2 大豆水溶性蛋白含量的测定

取10 mL样品液于消化管中，同时向消化管中加入12 mL浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定。

水溶性蛋白含量(w)按下式计算。

式中:V1为滴定样品液消化液所耗硫酸的体积，mL；V0为滴定空白液消化液所耗硫酸的体积，mL；C为硫酸标准滴定溶液浓度，mol/L；0.014 0为1.0 mL硫酸[C(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；6.25为大豆含氮量换算成蛋白质的系数；m为10 mL样品液对应的试样质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对大豆水溶性蛋白含量的影响

取5.000 g(精确到0.001 g)样品于50 mL离心管中，取50 mL蒸馏水加入离心管中。将离心管固定至恒温(35℃)水浴锅分别振荡30、60、90、120、150 min。以3 000 r/min的转速离心10 min，取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取时间对大豆水溶性蛋白含量的影响，结果见图1。

图1 提取时间对大豆水溶性蛋白含量的影响

从图1可以看出，随着提取时间的延长，大豆水溶性蛋白含量在30～90 min内显著增加，在90 min以后大豆水溶性蛋白含量变化不大，几乎处于平稳。大豆水溶性蛋白与蒸馏水之间的溶质浓度的平衡关系最终决定大豆水溶性蛋白的提取时间，为了保证大豆水溶性蛋白含量和稳定，选择120 min为最佳提取时间。

2.1.2 料液比对大豆水溶性蛋白含量的影响

取1.000 g(精确到0.001 g)磨碎的大豆样品于50 mL离心管中，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50向其加入蒸馏水，摇匀。在水浴锅内35℃振荡60 min，以3 000 r/min的转速离心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察料液比对大豆水溶性蛋白含量的影响，结果见图2。

图2 料液比对大豆水溶性蛋白含量的影响

从图2可以看出，当加水量较低时，大豆水溶性蛋白不能完全从大豆中析出，有一小部分残留在残渣中，使得水溶性蛋白含量偏低，随着加水量的增加，大豆水溶性蛋白含量整体趋势先上升，直到料液比达到1∶35时，大豆水溶性蛋白含量才趋于稳定。为了确保稳定并较为准确地提取大豆水溶性蛋白，采用料液比为1∶40。

2.1.3 提取温度对大豆水溶性蛋白含量的影响

取5.000 g(精确到0.001 g)样品于50 mL离心管中，加入50 mL蒸馏水，摇匀。在不同温度(15、20、25、30、35、40℃)的水浴锅中振荡60 min，以3 000 r/min的转速离心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取温度对大豆水溶性蛋白含量的影响，结果见图3。

图3 提取温度对大豆水溶性蛋白含量的影响

从图3可以看出，提取温度低于25℃时，随着温度的升高，水溶性蛋白质含量明显上升，当提取温度在25～30℃时，温度升高，水溶性蛋白质含量有小幅度的提高。因为随着温度的升高，一些难溶于水的蛋白质(如球蛋白)溶解于水，造成水溶性蛋白含量增加。当提取温度在30～40℃时，大豆水溶性蛋白含量稳定。为了提高实验效率并较为准确地测定大豆中水溶性蛋白含量，选择35℃ 为最佳提取温度。

2.2 正交实验

根据单因素实验结果，以大豆水溶性蛋白含量为评价标准，选择提取温度、提取时间、料液比进行三因素三水平L9(34)正交实验。正交实验因素水平见表1，正交实验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交实验因素水平

表3 方差分析

从表2可以看出，在3个因素中影响大豆水溶性蛋白含量的最主要因素是提取时间，其次是料液比，最后为提取温度，最优组合为A3B1C2。综合各因素作用，最终确定提取大豆水溶性蛋白最佳工艺条件为：提取温度30℃，提取时间120 min,料液比1∶40。在最佳工艺条件下，进行3次重复验证实验，所得大豆水溶性蛋白含量为34.63%。

从表3可以看出，提取温度、提取时间和料液比对大豆水溶性蛋白含量均有显著影响，都为主要的影响因素，具有统计学意义。

3 结 论

以东北大豆为原料，通过单因素实验及正交实验，并综合考虑各因素在实际中的简便、可行性，最终确定大豆水溶性蛋白提取的最佳工艺条件为：料液比 1∶40，提取时间 120 min，提取温度 30℃。在最佳工艺条件下，大豆水溶性蛋白含量为34.63%。