李峻志，戴 璐，祁 鹏，张黎光，李安利，刘 愚，王殿振，乔 婷，陈世明

(1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.陕西宁陕县秦南菌业科技有限公司，陕西 安康 711699)

秦岭是横亘于中国中部、东西走向的巨大山脉，是中国地理上重要的南北分界线，因其对海洋气流和寒潮的屏障作用，所以也是我国南北气候上的分界线。秦岭独特的地理环境和气候条件决定了它拥有得天独厚、丰富的大型真菌菌种资源[1]，但长期以来，没有持续、系统的针对秦岭地区羊肚菌种质资源的调查。为了探明秦岭地区羊肚菌种质资源现状和为后续的开发利用提供科学依据，研究团队在秦岭地区选择设计考察路线和调查样地，对野生羊肚菌进行了种质资源调查。本文对秦岭地区羊肚菌的考察结果进行了初报。

1 工作方法

1.1 种质资源调查

秦岭地域广阔、环境多样，本团队按照2008年开始的“秦岭微生物种质资源调查”项目[2]筛选出的秦岭羊肚菌种质资源相对丰富区域进行野外资源采集。在西安、宝鸡、安康、商洛、汉中等地按照饶俊的方法[3]建立了10个样地，具体调查区域和标本收集数据见表1。在样地中自海拔500 m～2 700 m向上进行调查工作，包括子实体典型标本的采集、拍照、编号和形态特征的基本描述，记录样地的地理位置信息、标本分布状况、土壤类型和生境等。

1.2 菌株分离鉴定

1.2.1 分离菌丝体 先对采集的羊肚菌进行初步的形态鉴定，然后进行菌丝体的分离纯化，具体方法参考陕西省微生物研究所真菌研究中心以往的工作[4-8]。

1.2.2 基因组DNA的提取和ITS区序列的分析 收集玻璃纸上的菌丝，用液氮研磨后，使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取样品基因组DNA，保存于4 ℃。使用2720 Thermal cycler PCR仪(ABI Applied Biosystems)和2×PCRmix(润德生物技术有限公司)PCR扩增ITS区，引物为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(北京奥科生物技术有限责任公司合成)。50 μL反应体系：引物各2 μL、模板2 μL、2×PCRmix 25 μL、ddH2O 19 μL。反应条件：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。以PCR产物直接测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将序列在GenBank上进行BLAST分析。

1.2.3 系统发育树的绘制 结合陕西省微生物研究所真菌研究中心秦岭羊肚菌鉴定结果[4-8]，选取部分菌株的ITS区序列，使用MEGA6构建邻接法系统发育树[9]。

2 结果与分析

2.1 秦岭地区野生羊肚菌种质资源调查结果

本部分工作记录了10个采集地的地理位置、标本采集数量和生境条件，结果见表1。部分子实体照片见图1。部分菌株在PDA培养基上的菌丝体生长形态见图2。

表1 秦岭地区羊肚菌种质资源调查结果

图1 采集的部分子实体

2.2 分离与鉴定结果

综合形态鉴定和分子鉴定结果可知，分离得到的115株羊肚菌纯培养菌株可分为5个种，分别为粗腿羊肚菌、高羊肚菌、尖顶羊肚菌、梯棱羊肚菌和七妹羊肚菌。具体结果见表2。

图2 部分菌株菌丝体在PDA平板上的形态

鉴定种属株数分布区域粗腿羊肚菌(M. crassipes)8610个样地均分布高羊肚菌(M. elata)12田峪河、冷水沟、红河谷、流岭尖顶羊肚菌(M. conica)15甘溪沟、平河梁、红河谷梯棱羊肚菌(M. importuna)1汉中云雾山森林公园七妹羊肚菌(M. septimelata)1汉中云雾山森林公园

限于篇幅， 5个种各选取1个菌株列举形态学鉴定结果如下：

QM-02为粗腿羊肚菌，菌盖黄褐色，近圆锥形，长5.5 cm，宽3.5 cm，凹坑不规则形或近圆形；柄黄白色，中空，长6 cm，最粗处5 cm，基部膨大、有凹陷腔室。子囊圆柱形，无色透明， 200～260×17～21 μm；子囊孢子8个，椭圆形，15～25×9.5～16 μm；侧丝顶端膨大。

M14为高羊肚菌，菌盖黑褐色，圆锥形，长6 cm，宽4.5 cm，脊黑色，有短绒毛，纵脊发达；菌柄白色中空，圆柱形，长4.5 cm，粗2cm；子囊圆柱形，无色透明；子囊孢子8个，椭圆形，光滑，25～28×11～15 μm；侧丝棒状，有隔，顶端稍膨大。

SXM-03为尖顶羊肚菌，菌盖深褐色，圆锥形、顶端稍尖，长5.3 cm，宽3.8cm，凹坑不规则，纵脊发达，黑色；菌柄白色中空，长5.5 cm，粗2 cm，圆柱形，表面有疣状凸起，基部有不规则纵沟；子囊圆柱形，无色透明，250～300×15～25 μm；子囊孢子8个，椭圆形， 20～24×11～15 μm；侧丝顶端膨大。

SXM-13为梯棱羊肚菌，菌盖黑褐色，不规则近圆锥形，长8.5 cm，宽5.6 cm；菌盖与菌柄连接的凹陷深3 mm；脊光滑锐利，凹坑光滑、排列成梯格状；菌柄白色中空，长4.5 cm，最粗处2.8 cm，基部棒状有纵向棱；子囊圆柱形、无色透明，180～300×10～25 μm；子囊孢子8个，椭圆形，光滑，20～25×10～15 μm；侧丝圆柱形，有隔，150～270×7～15 μm，顶端近棒状，在KOH溶液 (2%)中无色；不育脊上的刚毛100～200×10～28 mm，有隔，在KOH溶液 (2%)中棕色，末端细胞圆柱状。

SXM-15为七妹羊肚菌，菌盖黑褐色，不规则近圆锥形，长6.7 cm，宽4.4 cm；菌盖与菌柄连接的凹陷深4 mm；脊光滑锐利，凹坑光滑、竖直延展；菌柄白色中空，长4.2 cm，最粗处2.2 cm，基部棒状有凹陷腔室；子囊圆柱形、无色透明，160～275×15～25 μm；子囊孢子8个，椭圆形，光滑，15～25×10～20 μm；侧丝圆柱形，有隔，100～200×5～12 μm，顶端近纺锤状，在KOH溶液 (2%)中无色；不育脊上的刚毛50～220×7～20 mm，有隔，在KOH溶液 (2%)中棕色，末端细胞棒状。

Bootstrap验证，重复1000次

从图3可以看出，属于黑色羊肚菌类群[10]的高羊肚菌(M14、M15)、梯棱羊肚菌(SXM-13)、七妹羊肚菌(SXM-15)和尖顶羊肚菌(M17、SXM-03、SXM-04)与属于黄色羊肚菌类群的粗腿羊肚菌(QM-01、QM-02)遗传距离较远。

3 小结

因调查时间、地点、范围和人力的限制，本研究的种质资源调查显然未能涵盖、描述全部秦岭羊肚菌的种类分布，但从分子生物学角度明确了秦岭野生羊肚菌的5个分布种。将来还需不断地进行调查，进而补充完善秦岭羊肚菌种质资源数据。因为这些菌株均来源于秦岭山区原始生长状态环境，在长期的自然选择中，其生长结实对秦岭环境气候特点可能存在一定的适应性，基于这种考虑，我们希望将来从中选育出能够在秦岭山区典型环境下实现人工栽培的优良菌种。