李小玲,华智锐,何娇娇

(商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000)

黄芩(Scutellariabaicalensis)为唇形科黄芩属多年生草本植物,中药黄芩是《中国药典》收载的大宗中药,以根入药,其性味苦寒,具有抗敏杀菌、清热解毒等功效[1]。根据《中国植物志》记载,我国黄芩属植物共有102种,其中变种50种。野生黄芩植物资源分布广泛,但其多生长于干旱地区,水分是制约其生长的主要环境因子。商洛黄芩作为商洛的道地药材之一,应用历史悠久,作用范围广,需求数量较大,是商洛地区主要药材品种之一。商洛黄芩因播种常处于干旱多风季节,种子吸收水分的能力较差,发芽率低,幼苗生长能力差,严重影响了黄芩的质量和产量[2]。

研究发现,在干旱胁迫下,植物对Ca2+的吸收能力明显下降,其原因是植物根系对其生长环境中Ca2+的亲和力下降,造成植物体内Ca2+的缺失。研究结果证明,Ca2+可能是作为第二信使在细胞质内传递干旱信号并调节一系列生理生化反应[3]。另外,外源钙能有效调控植物体内抗氧化物质的合成、抑制膜质过氧化作用并提高植物体内抗氧化酶的活性,减少逆境对植物的伤害并提高植物的抗逆性[4]。研究表明,人工补充外源钙能够加强植物对Ca2+的吸收,提高植物内源钙的含量和钙调素(CaM)活性,在第二信使Ca2+-CaM充足的条件下,胁迫激素ABA通过诱导气孔关闭及胞液游离Ca2+水平升高,以减少水分散失,缓解干旱对植物的损伤[5]。

关于黄芩逆境生理研究近年来已取得了长足的进展,但多集中于研究高温、低温胁迫、盐胁迫等对黄芩药用成分累积等的影响,而对于黄芩在干旱胁迫下生理特性的变化的研究较少。因此,我们探讨了外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩生理特性的影响,分析了商洛黄芩幼苗对干旱胁迫的生理适应性反应,以期确定最适宜的外源钙施加方式及浓度,为黄芩耐旱机理研究以及抗旱品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用商洛黄芩幼苗于2017年4月购自商洛市洛南县药源种植基地。CaCl2及PEG-6000购自西安晶博有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 选取长势良好一致的黄芩幼苗，将其栽植于直径15 cm左右的花盆中进行预培养。在预培养2周后，待黄芩幼苗长至10～15 cm时，用PEG-6000配制成10%的溶液进行叶面喷施及根灌，以模拟干旱胁迫处理[6]。选取经干旱胁迫处理的黄芩幼苗24株,分别采用不同浓度的CaCl2或蒸馏水喷施及根灌,喷施时以叶片湿润而不滴水为度。喷施及根灌处理设置如下：对照(CK)，不含氯化钙的蒸馏水;处理1，5 mmol/L的氯化钙溶液;处理2，10 mmol/L的氯化钙溶液;处理3，20 mmol/L的氯化钙溶液;处理4，30 mmol/L的氯化钙溶液。

在干旱胁迫1周后,分别取样测定商洛黄芩幼苗叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量等生理指标。由于酶活性的测定具有不稳定性,因此试验中4个处理分别设置3盆重复,即每个处理重复3次。

1.2.2 各项生理指标的测定方法 POD活性的测定参照郝再彬等[8]的愈创木酚显色法; SOD活性的测定参照李合生[10]的氮蓝四唑(NBT)光还原法; MDA含量的测定参照张志良等[9]的硫代巴比妥酸法; CAT活性的测定采用紫外吸收法[10];脯氨酸含量的测定采用蒽酮比色法[10];可溶性蛋白质含量的测定参照高俊风等[11]的考马斯亮蓝G-250法;叶绿素含量的测定采用丙酮测定法[11]。

1.3 数据处理

所有处理每次测定重复3次,实验数据为3次测定的平均值。采用 Microsoft Excel 2007软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩叶绿素含量的影响

由图1、图2、图3可知：对照组与处理组相比,黄芩幼苗叶片叶绿素的含量明显降低,说明干旱胁迫对黄芩叶片中叶绿素含量有严重影响；喷施或根灌不同浓度的CaCl2后,叶绿素含量整体呈现出先上升后下降的趋势；当喷施或根灌10 mmol/L CaCl2溶液时,叶片叶绿素含量分别达到两种作用方式的最高值,分别高于对照组35%和26%；当喷施或根灌30 mmol/L CaCl2溶液时,黄芩叶绿素含量明显下降,且低于对照。因此，以叶面喷施方式施加10 mmol/L CaCl2溶液更能有效地缓解干旱胁迫对黄芩幼苗的伤害。

图1 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩叶绿素a含量的影响

图2 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩叶绿素b含量的影响

2.2 外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩体内保护酶活性的影响

植物体内的过氧化物酶与植物的呼吸作用、光合作用等密切相关,可有效地清除因逆境产生的活性氧和自由基，保持体内活性氧的平衡[13-14]。由图4、图5、图6可见：与对照相比,干旱胁迫下喷施或根灌不同浓度的外源钙后黄芩体内3种保护酶活性均有所上升,且随着喷施或根灌外源钙浓度的增加,这3种抗氧化酶的活性均呈现先上升后下降的趋势。

图3 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩总叶绿素含量的影响

从图4、图5还可以看出：叶面喷施10 mmol/L CaCl2溶液时黄芩体内POD、SOD活性均达到最高值,分别是对照的1.6倍、2.9倍；根灌不同浓度的外源钙时黄芩体内这3种保护酶的活性均呈现先上升后下降的趋势；在根灌10 mmol/L CaCl2时POD、SOD活性达到根灌时的最大值,分别是对照的1.5倍和2.4倍。经比较可知,施加相同浓度的外源钙时,叶面喷施对POD、SOD活性的作用效果分别比根灌高出10%和17%。这说明在干旱胁迫下商洛黄芩幼苗对叶面喷施10 mmol/L CaCl2的反应更为明显。

图4 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩POD活性的影响

由图6可知：喷施或根灌不同浓度CaCl2溶液处理下CAT的活性与对照相比也有所提高；在喷施或根灌10 mmol/L CaCl2溶液时,CAT活性均达到最高值,且叶面喷施下的CAT活性比根灌下的高出19 U/g。因此,以叶面喷施方式施加10 mmol/L CaCl2溶液最能有效地缓解干旱胁迫对黄芩造成的伤害。

图5 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩SOD活性的影响

图6 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩CAT活性的影响

2.3 外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩可溶性蛋白质含量的影响

可溶性蛋白质主要由体内参与各种代谢的酶类构成,它能维持细胞的渗透平衡及细胞膜与蛋白质的稳定[15]。由图7可知,随着喷施和根灌外源钙浓度的升高,植物体内可溶性蛋白质含量相比于对照均有所提高,在施加10 mmol/L CaCl2溶液时达到最大值,分别比对照高20%和19%，因此叶面喷施10 mmol/L CaCl2溶液的效果比根灌好些。差异显著性分析结果表明,与对照相比,喷施10 mmol/L CaCl2溶液后黄芩体内可溶性蛋白质含量变化不明显。

2.4 外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩脯氨酸含量的影响

由图8可知：在干旱胁迫下喷施或根灌一定浓度的CaCl2溶液均能有效提高黄芩幼苗中的脯氨酸含量；叶面喷施或根灌10 mmol/L CaCl2时黄芩幼苗体内脯氨酸含量均达到最大值,且叶面喷施处理的脯氨酸含量比根灌处理多0.7 mg/g。差异显著性分析结果表明,与对照相比,喷施10 mmol/L CaCl2溶液后黄芩体内脯氨酸含量变化显著。由此说明,叶面喷施10 mmol/L CaCl2溶液对黄芩幼苗渗透调节物质的积累作用最明显,从而可以有效缓解干旱胁迫对黄芩幼苗的损伤。

图7 PEG胁迫下施加外源钙对黄芩可溶性蛋白含量的影响

图8 PEG胁迫下施加外源钙黄芩脯氨酸含量的变化

2.5 外源钙对干旱胁迫下商洛黄芩MDA含量的影响

植物在遭受干旱胁迫时,体内MDA含量明显升高,随着MDA含量的累积干旱胁迫对植物的伤害愈发严重[16]。由图9可知,在干旱胁迫下,喷施或根灌外源钙溶液可以有效抑制黄芩幼苗体内MDA的累积,其中以施加10 mmol/L CaCl2溶液的效果最为显著。叶面喷施10 mmol/L CaCl2时黄芩体内MDA含量相比于对照下降了47%；根灌10 mmol/L CaCl2时黄芩体内MDA含量相比于对照下降了42%，因此叶面喷施的效果更佳。差异显著性分析结果显示,相对于对照组来说,喷施10 mmol/L CaCl2溶液处理下的黄芩体内MDA含量变化显著。

3 讨论

叶绿素含量的多少与光合速率的大小具有密切关系。干旱条件会导致植物叶绿素含量下降,进而导致光合速率降低,植株生长缓慢[17]。本研究结果表明,叶绿素a和叶绿素b的含量随着喷施或根灌外源钙浓度的增加而逐渐升高,当外源钙浓度为10 mmol/L时,叶绿素a和叶绿素b以及总叶绿素含量均达到最高值，随后开始下降。当外源钙浓度为30 mmol/L时,黄芩叶绿素含量比对照还要低。外施钙离子能够促进细胞与细胞之间水分的流动,从而减弱干旱胁迫下叶片水分的流失[19]。施加合适浓度的外源钙才能对黄芩幼苗叶片中叶绿素含量的提高产生最大的作用。

图9 PEG胁迫下施加外源钙后黄芩MDA含量的变化

植物体内清除活性氧、自由基的保护酶类主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等,它们协同作用对抗逆境引发的氧化损伤。干旱环境中保护酶活性增强或维持较高的水平,才能清除植物体内活性氧、自由基,使之保持较低水平,维持细胞膜的稳定性和完整性[18]。彭淼等[7]对钙对干旱胁迫下草莓各项生理指标的研究发现,Ca2+对细胞膜的保护作用具有浓度效应,若Ca2+长期以过高浓度存在于细胞质和细胞核中,则它将会同磷酸发生反应从而干扰以磷酸为基础的能量代谢。因此,只有一定浓度的外源钙才能在一定程度上提高黄芩幼苗的抗旱性。在本研究中,SOD、POD、CAT的活性随着喷施或根灌外源钙浓度的增加呈现出先升高后下降的趋势,其中以喷施10 mmol/L CaCl2溶液的效果最佳。由此可认为,外源钙对植物酶活性的保护作用是有浓度限制的,需要合适的施加方式和适宜的外源钙浓度才能发挥最佳的作用。

当植物遭受干旱胁迫时,体内蛋白质分解加速,合成受到抑制,造成植物体内可溶性蛋白质含量降低,影响植物的正常生理代谢过程[20]。本研究发现,以不同方式施加一定浓度的外源钙溶液后,黄芩体内可溶性蛋白质含量均有所升高,这是由于干旱胁迫能够刺激并激活受体细胞生物膜系统上的钙离子通道,激活不同种类的钙结合蛋白,与其他蛋白或调控转录因子相互作用,产生相应的调控机制,从而维持植物的正常生长发育过程[19]。

渗透调节是植物适应干旱胁迫的重要生理机制。脯氨酸是黄芩幼苗体内重要的渗透调节物质之一[21]。本研究结果表明,以不同方式施加外源钙均能明显提高黄芩幼苗体内脯氨酸含量,其中以叶面喷施10 mmol/L CaCl2溶液时的效果最为显著。

MDA(丙二醛)是植物在受到逆境伤害后细胞膜发生膜脂过氧化作用而形成的最终分解产物,其含量的多少代表了植物受逆境伤害程度的大小[22]。本研究结果显示，在干旱胁迫下施加外源钙溶液可以有效降低黄芩幼苗叶片内MDA的含量,从而降低电解质渗出率,从根本上减少因干旱导致的细胞膜脂过氧化作用对细胞膜造成的伤害,增强抗逆性[23]。

综上所述,在干旱胁迫下喷施或根灌一定浓度的外源钙溶液对商洛黄芩幼苗的各项生理指标均有所影响,但不同处理间仍存在差异。总体来说,以叶面喷施的方式施加外源钙对黄芩抵御干旱胁迫的伤害更有利,其中以10 mmol/L CaCl2溶液处理的效果最好。施加30 mmol/L CaCl2溶液时已经开始对植物产生了一些负面作用。