汪白云 杨柳 刘国良 朴成玉 李庆伟 薛慧 刘斌

[摘要] 目的 基于代谢靶标角度揭示补阳还五汤对APP/PS1双转基因小鼠的调节机制。方法 选取20只7月龄APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，建立阿尔茨海默病模型。将APP/PS1双转基因小鼠随机分为2组，即模型组和补阳还五汤组（9.26 g/kg）;另选取10只健康的BALB/c小鼠作为空白组。补阳还五汤组灌胃给予补阳还五汤，空白组及模型组给予生理盐水。连续灌胃35 d后进行Morris水迷宫实验，测定小鼠学习记忆能力。在此基础上，采用高通量液相色谱质谱联用技术对各组小鼠尿液进行全面分析，通过终端代谢产物回溯疾病发展过程中的关键代谢酶或代谢通路，聚焦APP/PS1雙转基因小鼠的发病机制以及补阳还五汤的作用机制。 结果 Morris水迷宫实验中，与空白组比较，模型组穿越平台次数明显减少（P < 0.01），补阳还五汤组穿越平台的次数显著增加（P < 0.01）、在目标象限的停留时间显著增加（P < 0.01）。空间定位航行实验中，补阳还五汤组较模型组的逃避潜伏期明显缩短（P < 0.01）。通过进一步尿液代谢轨迹分析发现，各组小鼠尿液聚类良好，空白组和模型组间分离明显，补阳还五汤组则处于两组间。通过分组贡献较大的差异离子分析发现其主要分布在鞘脂代谢和脂肪酸代谢。给予补阳还五汤后上述代谢通路明显呈回调趋势。经高分辨质谱鉴定获取了4个代谢异常的生物标志物，分别是花生四烯酸、神经胺、L-棕榈酰肉毒碱、甘油磷脂酰胆碱。通过组学数据处理平台Metaboanalyst 4.0的在线分析可知其主要涉及两种代谢通路，分别是鞘脂代谢和花生四烯酸代谢。 结论 补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠作用明显，可有效改善其学习记忆能为。调节氨基酸代谢及能量转化可能是其调节阿尔茨海默病的关键机制。

[关键词] 补阳还五汤;阿尔茨海默病;代谢组学;通路;机制

[中图分类号] R289.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0013-05

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease）是临床上常见的神经系统退行性疾病，其主要病理特征为β-淀粉样蛋白沉积所形成的老年斑及神经元丢失，近年来其发病率逐渐升高[1]。此外，阿尔茨海默病的发病机制尚不明确，且临床上确证有效的药物极少，因此阿尔茨海默病发病机制和有效药物亟待进一步深入研究[2]。近年来转基因实验动物逐渐成为研究阿尔茨海默病的焦点，其具备自发性代谢调控致阿尔茨海默病的特点，且病理机制和行为特征与阿尔茨海默病患者极为相似，是公认的现阶段研究阿尔茨海默病的最佳动物模型。但由于其价格过高，因此其应用范围存在一定的局限性。本研究选取APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，并基于高通量的尿液代谢组学技术获取转基因小鼠的代谢数据，为阿尔茨海默病的发病机制研究提供依据。

补阳还五汤出自清代王清任所著《医林改错》，具有补气、活血、通络之功效。大量研究[3-10]表明，补阳还五汤能显著降低大鼠β-淀粉样蛋白含量，改善脑部血液流变量，缓解动脉粥样硬化。本研究在评价APP/PS1双转基因小鼠空间探索能力和定位能力的基础上，采用代谢组学技术从代谢径路水平探究其发病机制，以期为补阳还五汤干预作用的药效机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 主要仪器  Q-ExactiveTM（美国Thermo Fisher Scientific公司）;ML-T分析天平（瑞士梅特勒托利多）;VDUPL超纯水机（九方沃德科技有限公司）;Morri水迷宫（安徽淮北正华生物仪器有限公司）。

1.1.2 主要试药  生黄芪（批号：131109）、当归尾（批号：131001）、赤芍（批号：121003）、川芎（批号：20140501）、地龙（批号：121002）、桃仁（批号：20140401）、红花（批号：130901），经黑龙江中医药大学佳木斯学学院周忠光教授鉴定均为正品。补阳还五汤水煎液由田明教授制备，水煎液经冷冻干燥制备成干粉（出粉率是34.11%，1 g干粉相当于生药量2.93 g），并保存于干燥器中，备用。

1.1.3 补阳还五汤处方组成  生黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g。

1.2 动物

选取雄性7月龄APP/PS1双转基因小鼠20只，体重（40±10）g，建立阿尔茨海默病小鼠模型;雄性7月龄清洁级BALB/c小鼠10只，体质量（30±10）g。实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：NO.211002300013 027。实验开始前，小鼠在动物室中适应7 d，并采用标准实验室水及食物喂养，动物室保持在22～26℃，相对湿度（50±5）%，暗/光循环12/12 h。

1.3 动物分组及代谢样本制备

20只APP/PS1双转基因小鼠根据体重数值按随机数列方法分为2组，即模型组和补阳还五汤组，每组10只。另选10只BALB/c小鼠作为空白组。空白组和模型组每天自由饮食和饮水，补阳还五汤组连续35 d灌胃给予9.26 g/kg的补阳还五汤[9]。实验第35天收集夜尿12 h，于4℃下以转速10 000 r/min离心20 min，取尿液上清液，置于EP管中，于-80℃下保存;代谢组学分析样本取原尿液，在上述条件下离心后，采用0.22 μm微孔滤膜滤过，以续滤液作为代谢物分析供试品溶液。

1.4 APP/PS1双转基因小鼠Morris水迷宫测试

末次给药后连续4 d给予相关训练，其后APP/PS1双转基因小鼠进行空间学习能力测试，具体分为两部分测试：首先进行空间定位航行实验，所有组小鼠均测试3次，取均值。将Morris水迷宫均分为4个象限，每个象限的坐标贴上标识。将APP/PS1双转基因小鼠沿象限标识放入水中，并开始计时，直至小鼠爬上水中平台，记录逃避潜伏期时间。然后进行空间搜索实验，撤去水下平台，将小鼠在相同如水地点放入水中，记录小鼠进入放置平台的所在象限消耗时间和进入该象限的次数。

1.5 代谢组学分析条件

色谱柱：Hypersil ODS C18（30 mm×4.6 mm，3 μm）（美国Thermo Fisher Scientific公司）;乙腈溶液作为流动相A，0.1%甲酸-水溶液作为流动相B;柱温31℃;流速为0.4 mL/min;进样量为4 μL;梯度洗脱方法见表1。

电喷雾离子源：采用Q-ExactiveTM质谱分析系统（高分辨四级杆串联轨道阱质谱仪）;脱溶剂气流量：800 L/h;脱溶剂气温度：300℃;锥孔反吹气流量：60 L/h;离子源温度：150℃;锥孔电压：35 V;毛细管电压：3.0 kV。

1.6 数据处理

代谢数据采用热电公司XCMS-Online分析软件对原始数据进行数据预处理，然后采用SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司）软件对代谢矩阵数据进行化学计量学分析，通过降维处理筛选组间差异贡献大的离子作为潜在生物标记物，结合VIP大于1和HMDB中收录的代谢物进行比对。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

2.1.1 三组小鼠定位航行能力  小鼠定位航行能力采用逃避潜伏期进行表示。随着训练时的延长，各组小鼠的逃避潜伏期缩短，小鼠的学习能力提高。补阳还五汤组小鼠第4天的逃避潜伏期较模型组同期低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与空白组比较，模型组小鼠的逃避潜伏期明显増加（P < 0.05或P < 0.01），提示模型小鼠出现显著学习障碍。与模型组比较，补阳还五汤组小鼠逃避潜伏期显著下降约45.85%，提示补阳还五汤能够在一定程度上改善AD小鼠学习能力。见表2。

2.1.2 三组小鼠空间探索能力  阿尔茨海默病小鼠的空间探索能力用穿越平台次数和靶象限停留时间表示。与空白组比较，模型组小鼠的穿越平台次数和靶象限停留时间明显减少（P < 0.01），提示模型组小鼠存在学习记忆障碍。与模型组比较，补阳还五汤组平台穿越次数和靶象限停留时间明显增加（P < 0.01），提示补阳还五汤能够一定程度地改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力。见表2。

2.2 代谢组学研究

本部分基于高分辨质谱技术对阿尔茨海默病小鼠模型尿液进行信息采集，进行数据预处理。最终带入Simcap 11.5进行模式识别分析。空白组和模型组两组组内代谢聚集明显，组间分离显著，补阳还五汤组则处于两组间，补阳还五汤组部分分布与空白组重合，提示补阳还五汤组整体代谢向健康状态发展，补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠有良好的干预作用。通过OPLS-DA筛选生物标记物。结合数据库共鉴定出潜在生物标记物4个（如表4），代谢通路富集分析，神经胺鉴定过程以神经胺为例。

4 讨论

花生四烯酸代谢是炎性反应代谢的重要组成部分。其在炎炎性反应过程中发挥重要作用。本研究监测到花生四烯酸代谢途径中花生四烯酸水平都有所升高。在氧化应激作用下，存在磷脂酶A2（sPLA2）的激活，激活的sPLA：通过增强蛋白激酶C（PKC）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）的活性，进而增加胞质型磷脂酶A2（cPLA2）的激活，促进花生四烯酸释放。它们水平的升高加重了氧化应激反应，进而加剧阿尔茨海默病的发展。

神经鞘脂类成分是构成神经组织的主要脂类。是胚胎发育阶段神经系统和血管系统形成的重要原料，具有神经细胞保护作用[11-14]。本研究发现阿尔茨海默病小鼠血液中神经胺含量降低，可能与阿尔茨海默病发展密切相关。细胞膜破裂是阿尔茨海默病最显著的特性退化之一，与膜脂质代谢异常有关。阿尔茨海默病患者脑内存在丰富的被激活的小胶质细胞，其作为中枢神经系统内的免疫细胞，激活可产生补体蛋白、炎症因子等神经毒性物质，从而激活免疫炎性反应产生神经毒性。

脂肪酸细胞结构、能源存储和信号转导的生物活性分子，神经元中占有非常高的水平（50%的神经元细胞膜是由多不饱和脂肪酸构成）。有研究[15-20]表明，高水平的自由脂肪酸导致大鼠β-淀粉样蛋白沉积和tau蛋白过度磷酸化，与阿尔茨海默病病程紧密相关。

本研究采用目前公认的APP/PS1双转基因小鼠作为阿尔茨海默病最佳动物模型，并基于高通量代谢组学技术对健康、疾病及给药的不同状态下小鼠尿液进行分析;通过模式识别和比对多元质谱库信息进行代谢物的鉴定，最终获得与阿尔茨海默病密切相关的生物学信息。给予补阳还五汤后，这些通路得到一定程度的抑制，推断得到的生物标志物代谢是补阳还五汤治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点。借助代谢组学技术，对补阳还五汤防治阿尔茨海默病的转基因小鼠血浆代谢组进行轮廓表征和模式识别分析，发现补阳还五汤的早期干预能明显影响阿尔茨海默病模型大鼠的代谢网络，初步判定了4个阿尔茨海默病生物标记物;通过追踪关键代谢产物相关联的代谢通路的变化规律，发现补阳还五汤影响的主要代谢经路包括脂类代谢、脂肪酸代谢等。

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（收稿日期：2018-10-06  本文編辑：王   蕾）