杨玉双 覃碧 甘霖

摘 要 为探索EMS处理对橡胶草种子萌发的影响，确定EMS诱变橡胶草种子的最适宜条件。本研究以橡胶草品系CXCH为材料，EMS为诱变剂，采用4个EMS处理浓度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%），3个处理时间（4、8和12 h），分别对诱变后的种子发芽率、发芽势、发芽指数、成苗率和相对成苗率进行分析。研究发现，EMS诱变处理不能显著抑制橡胶草种子发芽率，却能显著降低橡胶草种子的发芽活力（发芽势和发芽指数）和成苗情况（成苗率和相对成苗率），且EMS处理浓度对橡胶草种子的影响要大于处理时间的影响，并最终确定EMS处理浓度为0.30%、诱导时间为12 h时为橡胶草种子最适宜诱变条件。

关键词 橡胶草 ；化学诱变 ；甲基磺酸乙酯（EMS）

中图分类号 S576 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.001

Abstract In order to explore the effect of ethyl methyl sulfonate （EMS） treatment on seed germination of Taraxacum kok-saghyz Rodin （TKS） and optimize the conditions of EMS mutagenesis of TKS seeds， seeds of TKS line CXCH were treated with EMS at four EMS concentrations （0.10%， 0.20%， 0.30% and 0.40%） for 3 different durations of time （4， 8 and 12 hours） for mutagenesis. The treated seeds were germinated and cultured into seedlings， and their germination rate， germination vigor， germination index， seedling rate and relative seedling rate were analyzed. The results showed that the EMS treatment had little effect on the germination rate of TKS seeds， but had a significant inhibitive effect on germination vigor， germination index， seedling rate and relative seedling rate， and that the concentration of EMS had a higher inhibition effect on the seeds than the duration of treatment time. The seeds treated with EMS at a concentration of 0.30% for 12 hours were optimal for EMS mutagenesis.

Keywords Taraxacum kok-saghyz Rodin ； chemical mutagenesis ； ethyl methyl sulfonate （EMS）

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）为菊科（Asteraceae）蒲公英属（Taraxacum）大角蒲公英组（Sect. Macrocornuta V. Soest ）多年生草本植物[1-2]。因其根部橡胶含量高、品质优良、适应性强等诸多优点，成为最具发展前途的橡胶替代作物之一[3-5]。目前，橡胶草种质资源少，含胶量偏低，且橡胶草的异交特性和遗传复杂性使传统的育种效率低下，这严重制约着橡胶草的产业化进程。因此，利用育种技术创建突变体库，筛选优异突变体可为橡胶草育种提供新种质材料，推进橡胶草种质创新，而且创建突变体库还可为橡胶草基因遗传分析、基因定位与图位克隆及基因功能分析奠定基础，对于加快橡胶草育种进程意义重大。EMS作为一种高效、稳定的化学诱变剂，能够诱发点突变，其诱变效果效率高、频率高、范围广，而染色体畸变率相对较少，且多为显性突变体，易于突变体筛选，因而被广泛用于构建突变体库。目前，EMS诱变已成功应用于拟南芥[6]、玉米[7-8]、水稻[9]、小麦[10-11]、大麦[12]、大豆[13-14]、花生[15]、甘蓝[16]、番茄[17-18]等多种作物的诱变科研中。EMS诱变萌发试验是确定最佳EMS诱变条件的关键步骤[19]。科研人员分别对EMS 诱变对豆科[20-21]、十字花科[22]、茄科[23]等不同科的不同植物种子萌发的影响进行了研究，发现 EMS诱变抑制植物种子的萌发，且随着EMS处理浓度和时间的增加，发芽势、发芽率等参数呈下降趋势，并根据半致死剂量筛选获得相应物种最佳诱变条件。随着橡胶草全基因组测序的完成[24]，橡胶草突变群体构建工作显得尤为重要，但目前橡胶草种子的EMS诱变效应及最佳诱变条件的筛选工作尚未见报道。本研究以橡胶草品系CXCH为材料，采用4个EMS处理浓度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%），3个处理时间（4、8和12 h），分别对诱变后橡胶草种子发芽率、发芽势、发芽指数、成苗率和相对成苗率进行分析，探讨了EMS诱变处理对橡胶草萌发的影响，并根据半致死剂量筛选橡胶草种子最佳EMS诱变处理条件，为进一步构建橡胶草突变体库，筛选突变体、开展橡胶草育种和基因功能研究提供基础材料。此外，本研究也为其他作物开展EMS诱变研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

橡胶草材料CXCH，2016年种植于中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶草种质资源圃，2017年初收获种子。

1.2 方法

1.2.1 EMS处理

橡胶草种子EMS处理参照Kim等[25]的方法，并略作改动。采用4个EMS处理浓度：0.10%，0.20%，0.30% 和 0.40%，3个处理时间：4、8和12 h。具体流程如下：挑选健康饱满的橡胶草种子，100粒为1次重复，重复3次；将种子放入100 mL锥形瓶中，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.5），震荡过夜培养；在通风橱中，弃去缓冲液，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液，加入相应量的EMS（Sigma公司），室温下震荡培养相应时间；结束后，弃去EMS溶液，用40 mL蒸馏水清洗20次，最后一次清洗使种子在水中浸泡1 h；清洗后，将种子转入带有滤纸的培养皿中，放入26℃培养箱内催芽。

1.2.2 发芽相关指数测定

发芽率和成苗率测定：EMS诱变处理后，将各组种子分别放入带有滤纸的培养皿中，26 ℃培养箱内催芽。每天观察和记录种子发芽数量，以种子露白2 mm为标准，共催芽6 d，随后将种子播种于种质圃培养钵中，每天观察和记录出苗情况，28天以后计算成苗率和相对成苗率。

发芽率﹑发芽势﹑发芽指数﹑成苗率和相对成苗率的计算方法：

发芽率=（种子发芽数/供试种子数）×100%

发芽势=（发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数）×100%

发芽指数=∑Gt/Dt，其中Gt为在不同时间的发芽数；Dt为发芽日数

成苗率=（成活苗总数/供试种子数）×100%；

相对成苗率=（处理的成苗率/对照成苗率）×100%。

1.2.3 数据统计与分析

本试验数据用使用IBM SPSS Statistics 19 （IBM， New York， USA）软件进行数据处理﹑方差分析及LSD多重比较等，使用Microsoft office 2013进行图表制作，所有数据用平均值±标准误（means±SE）表示。

2 結果与分析

2.1 EMS处理对橡胶草种子发芽率的影响

由表1可知，同一处理时间下，各处理与对照相比，其发芽率随着处理浓度增加存在不同程度下降，但差异均未达到显著水平。同一EMS浓度下，不同处理时间的发芽率存在差异，其中，0.3%和0.4%处理12 h时发芽率都会有轻微下降，但差异也均不显著；可见，0%～0.4%的EMS处理浓度不会显著抑制橡胶草种子的发芽率（表2）。

2.2 EMS处理对橡胶草种子发芽势和发芽指数的影响

发芽势和发芽指数可体现橡胶草种子的发芽活力。同一EMS处理时间下（表1），橡胶草种子的发芽势和发芽指数随着EMS处理浓度增加而降低，且两个参数的变化趋势一致。当EMS处理浓度≥ 0.30%时，各处理浓度的种子发芽势和发芽指数与对照相比均达到显著水平（p<0.05），其中，0.4% EMS处理12 h的发芽势和发芽指数下降显著程度达到p<0.01水平。当EMS处理浓度≤0.10%时，各处理与对照相比差异不显著。

同一EMS处理浓度下（表2），橡胶草种子的发芽势和发芽指数随着处理时间增加均有不同程度降低，但除EMS 0.40%时，8、12与4 h处理之间的差异达到显著水平（p<0.05）外，其余处理间的差异均未达到显著水平。

可见，EMS处理浓度和处理时间均不同程度降低橡胶草种子的发芽势和发芽指数，其中，EMS处理浓度对其的影响要大于处理时间的影响。

2.3 EMS处理对橡胶草成苗率和相对成苗率的影响

同一处理时间下（表1），橡胶草种子的成苗率随着EMS处理浓度的增加而呈现不同程度下降。当EMS处理浓度≥0.20%，处理时间≥8 h时，各处理的出苗率均显著低于对照（p<0.05），当EMS处理浓度≤0.10%时，各处理的成苗率与对照相比无显著差异。当处理时间为4 h时，各处理对橡胶草种子的出苗率影响最小，除EMS 0.40%时差异显著外（p<0.05），其余浓度处理与对照相比均无显著差异。相对成苗率也表现出相似规律，当EMS处理浓度≥0.10 %，处理时间≥8 h时，各处理的相对出苗率均显著低于对照（p<0.05），当处理时间为4 h时，各浓度处理与对照相比均无显著差异。

同一处理浓度下（表2），成苗率和相对成苗率随着处理时间增加也均呈现不同的下降趋势。当成苗率和相对成苗率的EMS处理浓度分别≥0.30 %和≥0.20 %时，8、12与4 h处理之间的差异才达到显著水平（p<0.05），其余处理间的差异均未达到显著水平。

可见，EMS处理浓度和处理时间均不同程度影响橡胶草种子的成苗率和相对成苗率，其中，EMS处理浓度对其的影响要大于处理时间的影响。当0.30% EMS处理12 h时，橡胶草的成苗率为26.67%，相对成苗率为50.75%，最接近半致死剂量。因此，此组合可确定为橡胶草种子EMS诱变的最适宜剂量组合。

2.4 发芽相关参数与成苗率相关性分析

由表3可知，除发芽率与发芽势和发芽指数的相关性不显著外，其余参数间相关性系数均达到显著水平（p<0.05）。其中，发芽势与成苗率和相对成苗率的相关性最高，分别为0.92和0.96（p<0.01）；发芽指数次之，分别为0.88和0.94（p<0.01）；发芽率最低，分别为0.63和0.52（p<0.05）。可见，发芽势和发芽指数更能体现EMS处理后橡胶草种子的最终成苗情况。

3 讨论与结论

EMS处理可抑制种子的萌发，大量研究显示，随着EMS处理浓度和处理时间的增加，种子的发芽率和发芽势等参数呈下降趋势[26]。本研究显示，EMS对橡胶草种子的发芽率具有一定抑制作用，但作用并不显著，各处理发芽率与对照相比没有明显差异。这与西瓜和金花菜种子[27-28]等许多研究结果存在差异，进一步印证了不同物种对EMS的敏感性和诱变反应是存在差异的[29]。诱变处理浓度和处理时间对橡胶草种子的发芽活力具有抑制作用，其发芽势和发芽指数随着EMS处理浓度和时间的增加而逐渐降低，当EMS浓度为0.40%，处理时间为12 h时，发芽势和发芽指数与对照相比分别降低了45.57%和37.85%；其中，EMS处理浓度对橡胶草种子发芽活力抑制效应比处理时间更为明显，这与Liu和刑飞等[28， 30]的研究结果一致。

EMS诱变显著影响橡胶草种子的成苗率，EMS处理浓度和处理时间越高，橡胶草种子的成苗率和相对成苗率越低，且处理浓度对成苗的影响要大于处理时间。其中，0.40% EMS处理12 h的种子成苗率和相对成苗率分别只有12.67%和23.97%。这与王学征等[31]的研究结果一致。

EMS作为构建突变体育种的重要手段，诱变条件选择最为关键[19]。本研究显示（表1），橡胶草种子各处理的发芽率与对照相比无显著差异，而且发芽率和成苗率存在很大差异，此外相关性分析显示（表3），发芽率与成苗率和相对成苗率的相关性系数是几个参数中数值最低，分别只有0.63和0.52。可见，橡胶草用发芽率来推测EMS诱变半致死剂量是不准确的。因此，本研究依据成苗率和相对成苗率数据，基于橡胶草种子的半致死剂量[32]，筛选最适宜诱变条件。

本试验采用4个EMS处理浓度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）和3个处理时间（4、8和12 h）组合，通过对橡胶草种子发芽率、发芽势、发芽指数、成苗率和相对成苗率进行综合分析，确定最适宜EMS处理条件。结果显示，0.30% EMS处理12 h 的相对成苗率为50.75%，为最适宜EMS诱变条件。

参考文献

[1] 林伯煌，魏小弟.橡胶草的研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（13）：5 950-5 951.

[2] 罗士苇，吴相钰，冯 午.橡胶草的研究部分II -新疆产橡胶草的化学分析及其橡胶含量之测定[J].中国科学，1951，2（3）：381-387.

[3] Van Beilen J B， Poirier Y. Establishment of new crops for the production of natural rubber [J]. Trends Biotechnol， 2007， 25（11）： 522-529.

[4] 仇 建，张继川，罗世巧，等.橡胶草的研究进展[J].植物学报，2015，50（1）：133-141.

[5] 赵平娟，安 锋，林位夫，等.大力开展巴西橡胶树替代产胶植物及技术研发的建议[J].中国农学通报，2012，28（34）：124-130.

[6] Greene E A， Codomo C A， Taylor N E. et al. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis[J]. Genetics， 2003， 164（2）： 731-740.

[7] 樊双虎，郭文柱，路小铎，等.玉米EMS突变体库构 建及突变体初步鉴定[J].安徽农业科学，2014（11）：3 162-3 165，3 185.

[8] 石海春，谭义川，夏 伟，等.19份玉米EMS诱变系的遗传差异评价[J].华北农学报，2016，31（1）：110-116.

[9] 王 峰，徐 飚，杨正林，等.EMS诱变水稻矮生资源的鉴定评价[J].核农学报，2011，25（ 2）：197-201.

[10] 薛 芳，褚洪雷，胡志伟，等. EMS对新春11小麦抗性淀粉和农艺性状的诱变效果[J].麦类作物学报，2010，30（3）：431-434.

[11] 张纪元，张平平，姚金保，等.以EMS诱变创制软质小麦宁麦9号高分子量谷蛋白亚基突变体[J].作物学报，2014，40（9）：1 579-1 584.

[12] Caldwell D G， Mccallum N， Shaw P， et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley （Hordeum vulgare L.） [J]. The Plant Journal， 2004， 40（1）： 143-150.

[13] Cooper J L， Till B J， Laport R G， et al. TILLING to detect induced mutations in soybean [J]. BMC Plant Biology， 2008， 8（8）： 9.

[14] 吳秀红.EMS诱发大豆不同品种M2代与M3代农艺性状变异比较[J].中国农学通报，2012，28（27）：49-52.

[15] 殷冬梅，杨秋云，杨海棠，等.花生突变体的EMS诱变及分子检测[J].中国农学通报，2009，25（5）：53-56.

[16] 曲高平，孙妍妍，庞红喜，等.甘蓝型油菜EMS突变体库构建及抗除草剂突变体筛选[J].中国油料作物学报，2014（1）：25-31.

[17] Menda N， Semel Y， Peled D， et al. In silico screening of a saturated mutation library of tomato [J]. The Plant Journal， 2004， 38（5）： 861-872.

[18] 杨建华，崔 霞，常培培，等.EMS诱变番茄自交系TTD302A的突变表型鉴定和分析[J].中国蔬菜，2014，1（4）：21-28.

[19] Wang J G， Guo Y， Che D D， et al. RAPD analysis of M1 generation of Gladiolus hybridus Hort treated by EMS[J]. Journal of Northeast Agricultural University： English Edition， 2009（1）： 5-9.

[20] 梅凌锋，唐艳梅，唐晓敏，等.3种化学诱变剂对广金钱草种子萌发的影响[J].广东药学院学报，2015，31（3）：310-315.

[21] 吴兴兰，孙 超，燕丽萍，等.EMS对紫花苜蓿中苜一号种子萌发和生长的影响[J].山东林业科技，2015，2：1-3.

[22] 卢 银，刘梦洋，王彦华，等.EMS处理对大白菜种子萌发及主要生化指标的影响[J].中国蔬菜，11：20-24.

[23] 马海新，庞胜群，杨邦杰，等.EMS诱变对加工番茄种子萌发的影响[J].种子，2015，34（5）：28-33.

[24] Lin T， Xu X， Ruan J， et al. Genome analysis of Taraxacum kok-saghyz Rodin provides new insights into rubber biosynthesis[J]. National Science Review， 2018， 5： 78-87.

[25] Kim Y， Schumaker K S， Zhu J K. EMS mutagenesis of Arabidopsis[J]. Methods in Molecular Biology， 2006， 323： 101-103.

[26] 刘 威，杨 峰，任旭东，等.EMS对种子萌发影响的进展[J].分子植物育种，2017，15（11）：4 585-

4 589.

[27] Liu J X. Effects of induced concentration and time of EMS on seed germination of common Buckwheat [J]. Agricultural Science & Technology， 2015， 16（10）： 2 081-2 083.

[28] 邢 飛，王晓雪，任旭东，等.EMS诱变技术在水稻育种中的应用[J].南方农业，2016，06（10）：247-249.

[29] 曾新华.不同诱变方法对油菜种子诱变效果及突变体的研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[30] 胡志峰，魏臻武，唐 嘉.EMS诱变处理金花菜种子条件分析[J].草地学报，2017，25（2）：361-365.

[31] 王学征，朱娜娜，高清宇，等.EMS诱变西瓜种子条件分析[J].东北农业大学学报，2015，46（7）：35-39.

[32] 袁小环，武菊英，杨学军，等.基于半致死浓度的观赏草萌发期和幼苗期耐盐性评价[J].中国草地学报，2012（6）：49-53.