杨解解 陈鑫 薛鹏飞

摘 要：试验采用正交试验法探究不同OD值、侵染时间及外植体类型对诱导纹党产生毛状根的最佳条件，结果表明，采用OD值0.8A、侵染时间10min与纹党幼嫩叶片作为外植体的试验组处理效果最好，毛状根诱导率可达55.6%。纹党幼嫩叶片作为外植体诱导毛状根处理效果最好，纹党根、纹党茎段及无菌苗皆不适宜作为诱导材料。经形态学观察，诱导出的根基本符合毛状根的特征，PCR扩增得到865bp的DNA目的条带，证明试验得到的根为发根农杆菌R1601侵染诱导得到的毛状根。

关键词：党参；发根农杆菌；毛状根；组织培养

中图分类号 Q813.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0026-03

Abstract：In this experiment，the orthogonal test method was used to explore different OD values，infection time and explant type to optimize the hairy roots of the induced striate. The experiment showed that the OD value was 0.8A，the infection time was 10min and the pattern was young. The test group of the tender leaves as the explants had the best treatment effect，and the hairy root induction rate reached 55.6%. The young leaves of the striatum were the best for the treatment of hairy roots as explants，and the stalk roots，the stem segments and the sterile seedlings were not suitable as inducing materials.The 865 bp DNA target band was obtained by morphological observation and PCR amplification. The root obtained in this experiment was confirmed to be the hairy root induced by Agrobacterium rhizogenes R1601 infection.

Key words：Codonopsis pilosula；Agrobacterium rhizogenes；Hairy root；Tissue culture

黨参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.），桔梗科党参属，多年生草本植物，为中国常用的传统补益药，含有生物碱、蔗糖、菊糖、葡萄糖、淀粉、粘液质及多种微量元素、维生素B1、B2等，特别是硒含量较高，能有效抑制癌症发生，增强免疫力[1]，极具开发价值和应用价值[2]。

目前对党参的研究主要集中在药理、药材鉴定、化学成分分析等方面，关于离体组织培养的研究较少。随着基因工程的发展，已在多种植物上利用发根农杆菌成功诱导了毛状根，红豆[3]、喜树[4]、银杏[5]、杜仲[6]、乌桕[7]等是木本植物中最具代表性的。纹党的皂苷、多糖、硒主要存在于根部，而其他部位含量相对较低[8]，毛状根中含有和原植物中相同或相似、含量相当甚至更多、以及分化程度和遗传稳定性高且不易变异的次生代谢产物，还可从毛状根培养物中寻找新的化合物。建立毛状根培养体系，可为纹党皂苷、多糖、硒及其他次生代谢产物的生产提供一条新途径。

本试验以纹党无菌苗的叶片、纹党茎段、纹党根，纹党幼嫩叶片作为受体，用发根农杆菌侵染，对纹党毛状根诱导条件做初步研究，并进行PCR分子鉴定和毛状根外观鉴定，为后续试验准备丰富的材料，奠定纹党遗传转化与利用发根体系生产有用次生代谢产物的基础，为纹党可持续开发利用及其次生代谢物质的规模化、工厂化生产提供科学依据和技术支撑，也为发根农杆菌诱导其他木本植物提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 发根农杆菌R1601，文县纹党（2016年3月16日于甘肃陇南文县取样，苗龄20d），DNA提取试剂盒（天根生化试剂（北京）有限公司）。

1.2 发根农杆菌活化与悬液制备 将发根农杆菌菌株R1601接种于100mL LB液体培养基（含50mg/L卡那霉素）中震荡培养26℃活化12h，取1mL菌液于100mL LB液体培养基26℃再活化1次。再用离心管取一定体积的菌液在转速5000rpm，离心10min，弃去上清液，收集菌体，将其转移至1/2MS液体培养基中，调节菌液浓度OD值为0.5A、0.8A、1.0A、1.5A、2.0A备用。

1.3 材料预处理 将幼嫩纹党苗叶片与带芽茎段于流水下冲洗15min，无菌条件下0.1%HgCL2中漂洗10min，无菌水漂洗5次。纹党无菌苗叶片剪成0.5～1.0cm2大小，带芽茎段剪成0.5～1.0cm，最后用刀片在叶片和带芽茎段上划痕。

1.4 发根农杆菌转染纹党 根据表1的正交试验设计，取不同OD值的菌液侵染预处理好的外植体，用无菌滤纸吸干菌液，将外植体置于1/2MS培养基中26℃暗培养2～3d，后于含200mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基上做脱菌处理[8]，每3d转移1次，直至不再长菌为止。长出毛状根后，统计毛状根根数，培养至毛状根数量不再有明显增加时停止统计，待毛状根长至3～5cm时进行继代培养。另设一对照组，用无菌水代替菌液。

1.5 毛状根鉴定 取脱菌完全、生长良好的毛状根3份与自然条件下生长的纹党幼嫩叶片，用试剂盒提取总DNA，用作PCR检测的模板，根据Slightom等[9]发表的Ri质粒序列，设计PCR扩增引物为：引物1（TTACTGCAGCAGGCTTCATG）和引物（GGCTTTCCCGACCAGAGACT），预计扩增产物为865bp；PCR反应体系为[10]：无菌双蒸水13μL，10×PCR buffer2.0μL，MgCL2（25mmol/L）1.6μL，taqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，dNTPs（2.5mmol/L）0.2μL，引物1（0.8μmol/L）1μL，引物2（0.8μmol/L）1μL，模板（50ng/μL）DNA2μL；PCR程序为：95℃、2min，40个循环（94℃，40s；57℃，30s；72℃，1min），72℃、6min，4℃保存。扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳，核酸染色剂染色分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果 经正交试验可知（表2），采用OD值0.8A、侵染时间10min与幼嫩叶片的试验组处理效果最好，毛状根诱导率可达55.6%（图1）。以纹党根和纹党无菌苗叶片作为外植体不能诱导出毛状根，可能由于无菌苗叶片过于纤弱，经菌液处理和转移到新环境后细胞受到损伤，加之不适应环境导致细胞死亡。纹党带芽茎段和纹党幼嫩叶片皆可诱导出毛状根，但比较相同侵染条件下，纹党幼嫩叶片诱导率比茎段高，更适于作诱导材料，但其整体诱导率都不高。

其他条件相同情况下，OD值调整为0.8A处理效果最好，OD值过低，菌液浓度不够，侵染成功率低；OD值过高，菌液浓度过高，不利于后续除菌，材料易染菌死亡。其他条件相同情况下，侵染时间为10min处理效果最好，侵染时间过短，质粒来不及整合到植物DNA上；侵染时间过长，植物细胞易受损死亡。

2.2 分子检测结果 试验诱导出的根多分枝、多根毛、无向地性，呈毛发状，呈现出毛状根的基本形态，且以无菌水代替菌液的实验没有得到诱导根。另外随机选取3个幼嫩叶片诱导的毛状根，经PCR扩增得到了865bp的目的DNA片段（图2），且以纹党叶片DNA为模板的扩增，没有扩增到条带，表明发根农杆菌R1601的Ri质粒中的T-DNA序列含有的rolB基因已经整合进纹党的基因组中，证明该试验得到的毛状根为发根农杆菌R1601侵染诱导所致。

3 讨论

试验结果表明，采用OD值0.8A、侵染时间10min与幼嫩叶片作为外植体的试验组处理，毛状根诱导率可达55.6%。纹党幼嫩叶片作为外植体诱导毛状根处理效果最好，纹党根、纹党茎段及无菌苗皆不适宜作为诱导材料。一般组织培养和诱导试验采用的常为无菌苗，但纹党无菌苗纤细弱小，组织和细胞过于脆弱，在进行侵染和共培养时，由于菌液的影响和对新环境的适应性差极易导致死亡，所以不适于作为诱导毛状根的材料，并且培养适合的无菌苗时间长，影响试验进度。本试验适宜的OD值与侵染时间与姚庆收等[10]的研究结果相当，都保持在0.5～0.8A、8.0～10.0min。经形态学检测发现，诱导出的根初步具备毛状根特征，分子检测结果进一步说明其为毛狀根。本次试验虽诱导出了毛状根，但毛状根诱导率低且数量少，后续可从其培养温度、共培养时间、脱菌方案、菌种选择等方面加以改进，为药用植物毛状根诱导及利用毛状根生产有效药用物质的研究提供理论基础。

参考文献

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[2]王洁，邓长泉，石磊，等.党 参 的 现 代 研 究 进 展[J].中 国 医 药 指 南 ，2011，09（31）：279-281.

[3]王伟，陆杨，李礼，等.喜树毛状根的诱导及其喜树碱含量分析[J].西北植物学报，2008，28（12）：2416-2422.

[4]刘树楠，孙天恩，李根保.银杏发根的转化及其悬浮培养无性系的建立[J]. 武汉大学学报（理学版），1998（2）：238-240.

[5]杨蕊，张家辉，孙雪梅，等.杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的研究[J].中国中药杂志，2009，34（15）：1902-1905.

[6]黄素梅，石丸幹二.乌桕毛状根培养与次生代谢产物累积研究[J].北方园艺，2011（22）：103-105.

[7]Jia Z，Koike K，Nikaido T，et al. Triterpenoid saponins from Ardisia crenata and their inhibitory activity on cAMP phosphodiesterase[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1994，42（11）：2309-2314.

[8]任如意，李思璇，金秋，等.发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化[J].北方园艺，2017（8）：115-119.

[9]Slightom JL，Durand-Tardif M，Jouanin L，et al.Nucleotidesequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenesagropine type plasmid. Identification of open reading frames[J].Journal of Biological Cemistry，1986，261（1）：108-121.

[10]姚庆收，陈向明，马玉娥.蒙古黄芪毛状根的高效诱导及毛状根生物量和总黄酮含量的比较分析[J].中药材，2017.

（责编：徐世红）