任佳 高莉 谭雪 闫明

摘要：目的  观察类叶升麻苷对脑缺血再灌注大鼠学习记忆及炎症因子的影响，探讨其相关作用机制。方法  30只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组和类叶升麻苷低、高剂量组，每组6只。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞慢性缺血再灌注痴呆大鼠模型，通过跳台、Y迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，采用流式细胞仪及ELISA试剂盒测定血清、海马及皮层中白细胞介素（IL）-1α、IL-2、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素-γ（IFN-γ）的含量。结果  Y迷宫实验结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠新异臂进入次数减少，其他臂进入次数增加，新异臂潜伏期增加（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，尼莫地平组和类叶升麻苷低、高剂量组大鼠新异臂进入次数增加，其他臂进入次数减少，新异臂潜伏期减少（P<0.05，P<0.01）。跳台实验结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠测试期潜伏期减少，犯错误次数增加（P<0.01）;与模型组比较，类叶升麻苷低、高剂量组大鼠测试期潜伏期增加，犯错误次数减少（P<0.05，P<0.01）;流式细胞仪及ELISA试剂盒检测显示：与假手术组比较，模型组大鼠血清、海马和皮层IL-1α、IL-2、TNF含量明显增加（P<0.05，P<0.01），海马IFN-γ含量明显减少（P<0.05）;与模型组比较，类叶升麻苷低、高剂量组大鼠血清、海马和皮层IL-1α、TNF含量明显降低，血清、海马IL-2明显降低（P<0.05，P<0.01），海马IFN-γ含量明显增加（P<0.01）。结论  类叶升麻苷可提高MCAO大鼠学习记忆能力，且可有效降低模型大鼠炎症因子水平，其对模型大鼠的防治作用可能与抑制炎症反应有关。

关键词：类叶升麻苷;缺血再灌注;学习记忆功能障碍;炎症因子

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）04-0047-05

血管性痴呆主要是指同脑血管疾病具有关联的痴呆，因脑血管因素而形成了认知与智能等功能障碍。类叶升麻苷（Acteoside，AS）又名毛蕊花糖苷、麦角甾苷，是肉苁蓉中一种水溶性较强的苯乙醇苷类活性成分，具有抗氧化损伤、神经保护、改善记忆、调节免疫的作用[1-2]。前期研究发现，AS可显著改善双侧颈总动脉结扎法所致血管性痴呆引起的学习记忆功能减退和抑郁情绪障碍，并通过降低血清和脑组织丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）含量及提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，减少氧化应激损伤。因此，本研究采取制作大脑中动脉栓塞慢性缺血再灌注）模型[3-4]模拟血管性痴呆，从学习记忆损伤、炎症因子表达等方面探究AS对在体动物缺血再灌注所致血管性痴呆的神经保护作用及其相关机制。

1  实验材料

1.1  动物

清洁级雄性SD大鼠50只，体质量（360±20）g，购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（新）2011-0001。大鼠均饲养于石河子大学SPF级动物房，温度20～25 ℃，12 h/12 h光照明暗交替，自由摄食饮水。

1.2  主要药物与试剂

AS（纯度≥98%），本实验室自制;尼莫地平片，亚宝药业集团股份有限公司，批号170602。

1.3  主要试剂与仪器

大鼠白细胞介素（IL）-1α高通量液相蛋白定量试剂盒，北京中原合聚经贸有限公司;大鼠IL-2高通量液相蛋白定量套装，北京中原合聚经贸有限公司;大鼠肿瘤坏死因子（TNF）高通量液相蛋白定量套装，北京中原合聚经贸有限公司;干扰素-γ（IFN-γ）ELISA测定试剂盒，上海江莱生物有限公司。XR-XY1032 Y迷宫视频分析系统（上海欣软信息科技有限公司），YLS-3TB跳台记录仪（济南益延科技发展有限公司），流式细胞仪、Go1510全波长酶标仪（Thermo Fisher），Allegra 64R离心机（BECKMAN），TL2010S高通量组织研磨仪（SOP-EQ036）。

2  实验方法

2.1  造模

10%水合氯醛腹腔注射300 mg/kg麻醉，去除颈前鼠毛并消毒。沿颈部正中切开，在右侧肩胛舌骨和胸锁乳突肌形成的三角处，以止血钳钝性分离，暴露颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。结扎ECA分支枕动脉、甲状腺上动脉及ECA終末支，分离ICA颅外分支翼腭动脉。将ECA结扎并剪断，把ECA远心端拉直与ICA成直线，并在分叉处松松结扎一根4-0丝线。用动脉夹夹闭CCA、ICA，在ECA上剪一小切口。移去CCA上的动脉夹，缝合皮肤。假手术组大鼠只分离CCA、ECA和ICA，不插入栓线。MCAO大鼠麻醉清醒后，参照Longa等[5]及Bederon等[6]的5分制评分方法对实验大鼠的神经行为学进行评分，2～4分者纳入实验。

2.2  分组和给药

造模完成后，按照大鼠体质量及神经行为学评分双因素对模型大鼠进行筛选分组，选取造模成功大鼠30只。假手术组6只，将其余造模成功24只大鼠随机分为模型组、尼莫地平组（12.5 mg/kg）、AS低剂量组（6.25 mg/ kg）、AS高剂量组（12.5 mg/kg），每组6只。各给药组予相应剂量药液灌胃，假手术组和模型组予等体积超纯水灌胃。给药体积0.1 mL/100 g，每日1次，连续21 d。

2.3  行为学测试

2.3.1  Y迷宫实验

Y迷宫训练：新异臂被隔板挡住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活动10 min，训练结束后，大鼠被放回饲养笼。Y迷宫检测：训练结束后4 h进行，抽开新异臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3个臂中自由活动5 min。录像记录5 min内每只大鼠在各个臂停留的时间和穿梭次数。统计并分析大鼠在各个臂停留时间占总时间百分比、进入次数及新异臂潜伏期。

2.3.2  跳台实验

在开展实验前，将大鼠放入跳台仪的反应箱内适应环境3 min。跳台训练：用手抓住大鼠背部放在跳台箱的平台上，然后立即通36 V交流电，训练5 min，记录计时开始至大鼠第1次跳下平台遭受电击的时间（潜伏期）及大鼠下台遭受电击的次数（错误次数）作为学习成绩。跳台测试：训练结束后24 h测试其记忆能力，记录潜伏期及即错误次数，作为记忆成绩。

2.4  指标测定

行为学实验结束后，腹主动脉取血，4 ℃、3000 r/min离心15 min，取血清分装后置于-80 ℃保存。冰上剥离大鼠脑组织，分离出海马及皮层，分别制成10%、20%脑组织匀浆，4 ℃、3500 r/min离心10 min，取上清液分装后置于-80 ℃保存。取血清、20%海马及皮层，流式细胞仪检测IL-1α、IL-2、TNF含量;ELISA检测10%海马及皮层IFN-γ含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析，实验数据以x（—）±s表示，采用方差分析及多组间均数两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  类叶升麻苷对模型大鼠Y迷宫实验测试指标的影响

模型组大鼠新异臂进入次数显著低于假手术组（P<0.01），各给药组大鼠新异臂进入次数显著高于模型组（P<0.05，P<0.01）;新异臂停留时间占总时间百分比差异虽无统计学意义（P>0.05），但存在趋势，模型组相对较低;模型组大鼠新异臂潜伏期显著高于假手术组（P<0.01），各给药组大鼠新异臂潜伏期显著低于模型组（P<0.01），起始臂进入次数低于模型组;模型组大鼠其他臂进入次数显著高于假手术组（P<0.01），各给药组大鼠其他臂进入次数明显低于模型组（P<0.05，P<0.01）;起始臂及其他臂停留时间占总时间百分比各组间差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

4.2  类叶升麻苷对模型大鼠跳台实验测试指标的影响

模型组大鼠潜伏期较假手术组明显降低（P<0.01），各给药组大鼠潜伏期显著高于模型组（P<0.05，P<0.01），结果见图1。模型组大鼠犯错误次数较假手术组明显增加（P<0.01），各給药组测试期大鼠犯错误次数较模型组明显减少（P<0.05，P<0.01）。结果见图2。

4.3  类叶升麻苷对模型大鼠血清、海马及皮层白细胞介素-1α、白细胞介素-2、肿瘤坏死因子和干扰素-γ含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清、海马和皮层IL-1α、IL-2、TNF含量明显增加，海马IFN-γ含量明显减少，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，AS低、高剂量组大鼠血清、海马和皮层IL-1α、IL-2、TNF含量明显降低，海马IFN-γ含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01），尼莫地平组大鼠血清IL-1α、IL-2含量明显降低，海马和皮层IL-2、TNF含量明显降低，海马和皮层IFN-γ含量明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图3～图6。

5  讨论

本实验采取MCAO方法建立血管性痴呆大鼠模型，模拟血管性痴呆的发病过程，观察AS对血管性痴呆的影响。Longa神经体征评分对脑缺血造模成功的判定是一种客观、准确且简便的方法，凡表现病理性神经体征的大鼠均造模成功。Y迷宫实验主要研究啮齿类动物的空间识别记忆能力，该迷宫利用了啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性，不需要动物学习任何规则趋利避害，能有效反映动物对新异环境的识别记忆能力。根据Y迷宫实验结果可知，模型组大鼠对新环境的识别能力下降，而尼莫地平组和AS低、高剂量组可显著提高该能力，增强大鼠对新环境的探索及记忆能力。跳台实验主要考察动物的被动记忆能力，模型组大鼠跳台实验潜伏期显著高于假手术组且犯错误次数明显增加，而尼莫地平组和AS低、高剂量组可显著增加潜伏期并减少犯错误次数，说明AS能够明显改善大鼠学习记忆功能障碍。

脑缺血再灌注损伤后大脑会产生一系列病理变化，包括自由基生成增多、神经细胞凋亡、Ca2+水平失衡，炎症反应等，其中炎症反应是脑缺血损伤的重要机制之一。IL-1是一种常见的致炎因子，其中IL-1α作为一种重要的促炎因子，参与机体抗微生物感染、无菌炎症以及部分自发炎症的调节，IL-1α可促进炎性介质和氧自由基的释放，作用于脑组织血管内皮，引起脑水肿，并产生一系列级联放大的炎症反应，最终导致脑组织损伤。IL-2是一种激活T细胞并维持T细胞分化和增殖的T细胞生长因子，同时也参与炎症或自身免疫性反应。IL-2不仅可以刺激活化T细胞分泌淋巴因子，参与机体的免疫调节作用，而且可增强T淋巴细胞、单核细胞的细胞毒性。研究发现，IL-2可抑制降钙素基因相关肽（CGRP）的合成和释放，而CGRP能拮抗ET从而引起脑血流量的减少[7]。甘佳乐等[8]研究发现，MCAO大鼠模型可导致IL-2显著增多，从而产生炎症反应。本实验结果显示，尼莫地平及AS均可显著降低血清IL-1α、IL-2的含量，而AS还可明显减少海马及皮层IL-1α、IL-2的含量，说明AS较尼莫地平对脑组织中炎症因子具有更为明显的作用。TNF是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，但其在高浓度时会诱导炎症反应，导致一些如脓毒性休克等病理结果。研究发现，AS可显著降低大鼠血清、海马和皮层TNF含量，而尼莫地平组仅可降低皮层中TNF含量，这可能与2种药物作用机制不同有关，AS改善大鼠缺血再灌注的作用可能与调节炎症因子的作用途径更相关，而尼莫地平主要通过舒张血管、改善脑部微循环起作用[9]。IFN-γ是一种高效的抗病毒生物活性物质，并可增强NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用[10]。AS主要增加血清及海马中IFN-γ含量，对皮层中IFN-γ含量影响不大，这可能与AS的作用靶点和靶点剂量敏感性不同以及脑内血液循环等相关，有待进一步研究。

本实验结果表明，与模型组比较，AS可明显改善模型大鼠的学习记忆功能障碍，显著降低血清、海马及皮层IL-1α、IL-2及TNF含量，并增加IFN-γ含量。因此，AS可能是通过抑制脑缺血后炎症反应，对机体产生免疫调节作用，从而起到保护神经细胞的作用，改善缺血再灌注损伤，进而发挥其神经保护及改善学习记忆能力的作用。

参考文献：

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[10] 方明，张国庆.清气化痰汤加减联合西医治疗急性期COPD疗效观察及对血清INF-γ、TGF-α的影响[J].中药材，2018，41（4）：992-994.

（收稿日期：2018-08-29）

（修回日期：2018-09-24;编辑：华强）