颜晓元 周 伟

（土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京 210008）

长江三角洲（简称“长三角”）地区是我国主要的粮食生产区之一，也是氮肥施用量最高的地区之一，由此造成的地下水硝态氮污染问题早有报道［1］，但关于该地区农田地下水的研究多集中于稻麦轮作稻田。近年来，随着城市化的发展，长三角地区越来越多的水稻田转变为蔬菜地和果园［2］，已有的研究发现，蔬菜地和果园表层土壤存在明显的累积［3-4］。由于容易随水扩散，累积在表层土壤中的会随降水或灌溉水淋洗出作物根层，直至进入地下水，或者累积于深层土壤［5］。例如，Zhou等［6］研究表明，中国北方半干旱农田土壤剖面普遍存在明显的N累积，其中最高值出现在果园土壤，在0～4 m土壤剖面累积量高达2 155 kg·hm-2（以N计，下同），即便是累积量最小的小麦土壤，N累积量也高达453 kg·hm-2。

地下水通常埋藏于地表之下，土壤的阻滞作用与水压的存在，使得地下水中的气体难以逸散至地表，因此，可通过测定地下水中溶解态N2总浓度及其自然溶解度，二者的差值可表示为反硝化所产生N2（以下简称“exN2”），该法被称之为N2直接定量法。Blicher-Mathiesen等［12］发现地下水中exN2的增加量与NO3--N的减少量相吻合，认为可利用N2直接定量法来研究地下水反硝化。Fox等［13］也发现exN2浓度与地下水反硝化速率之间有着很好的相关性，即高浓度的exN2出现在反硝化速率最高的河岸地区，而在反硝化较弱的农田缓冲带，地下水exN2浓度较低。其他研究者也发现了类似的规律，说明N2直接定量法能真实反映地下水反硝化的强弱［13］。膜进样质谱仪（MIMS）可通过测定水样中N2∶Ar的变化，获得水中溶解性N2的浓度，与同位素质谱法（IRMS）相比，MIMS测定水中溶解态N2无需繁琐的前处理过程，测定过程简单快速，费用也大幅降低［14］。N2直接定量法不但可用来评估反硝化反应的强弱，还能推算出地下水的初始浓度，因此，被广泛用于含水层土壤和地下水反硝化研究。

本研究以太湖地区3种典型农田为研究对象，通过两年的野外观测结合室内培养实验研究了不同种植模式下农田地下水及exN2的浓度变化，目的在于：（1）探明不同种植模式下农田土壤及地下水浓度剖面分布特征；（2）验证农田土壤剖面是否存在累积现象；（3）明确反硝化对地下水的去除效率及主要影响因素。

1 材料与方法

1.1 研究地点概况

本研究依托中国科学院常熟农业生态实验站（31°32′N,120°41′E）进行。该实验站隶属于太湖流域典型区域，农业种植制度从偏重粮食生产转向粮经作物（水果和蔬菜）协调发展。该地区气候类型为亚热带季风气候，年平均气温16.1℃，年平均降水1 100 mm。选择3种当地典型农业种植模式为研究对象，分别为水稻田、蔬菜地和葡萄园。水稻田为中国科学院常熟农业生态实验站长期试验用地，面积约3 hm2，为稻麦轮作模式，氮肥年投入量为470 kg·hm-2。蔬菜地位于中国科学院常熟农业生态实验站北侧1.5 km处，面积约4.5 hm2，2009年由水稻田转变为蔬菜地，主要以种植叶菜类蔬菜为主，氮肥年投入量约为600 kg·hm-2。葡萄园位于中国科学院常熟农业生态实验站南侧2 km处，面积约5 hm2，2005年由水稻田转变为葡萄种植园，氮肥年投入量约为590 kg·hm-2。供试土壤为当地有代表性的普通潜育水耕人为土（乌栅土）。

1.2 样品采集

1.2.1 原状土壤采集 于2016年5月份进行土壤样品采集。在水稻田、蔬菜地和葡萄园各随机取3个采样点，利用单人手持式高频振动原状土壤取样钻机（VD51，澳大利亚）进行取样，每个采样点取0～4 m完整土柱。每个点连续采样4次，最后采至4 m深，共4根连续土柱。土壤采集后尽快带回实验站密封保存于4℃冰箱中，用于反硝化速率的测定。

1.2.2 地下水采样井布设 2015年2月份建设地下水采样井。在水稻田、蔬菜地和葡萄园各随机确定3个采样点，选择管口直径为6 cm的三型聚丙烯（PPR）管作为地下水采样井，PPR管底部封口，四周开具直径3 mm的小孔，并用100目的尼龙纱网包裹，以过滤水样。选用与PPR管口径相同麻花钻在选定位置钻孔至相应深度，然后将PPR管插入钻孔，埋设好的PPR管高于地面0.5 m，便于采样。每个采样点布设4个采样深度，分别为1 m、2 m、3 m和4 m，共布设有36个地下水采样井，采样井分布见图1。采样井布设完毕后48 h内抽空地下水5次以上，确保地下水取样的准确性。

图1 地下水采样井点位分布Fig. 1 Distribution of the wells for sampling groundwater

1.2.3 地下水取样 2015年4月至2017年4月进行地下水采样，采样频次为每月2次，采样前提前24 h将监测井中的水抽干，以确保采集的水样为新鲜水样。利用可调速蠕动泵（BT100M，保定创锐泵业有限公司）采集地下水样，蠕动泵流速控制在50 mL·min-1以内，以减少采样过程水中溶解性气体的自然逸散，具体采样过程参照Weymann等［15］所述方法。采集好的样品存于7 mL螺口取样瓶（Labco Limited, 英国）中，放入4 ℃冰箱保存，用于测定地下水中溶解性N2和Ar含量。另取一份水样存于100 mL塑料瓶中用于测定地下水中N2O、溶解性有机碳（DOC）、和浓度。水样采集的同时，利用手持式多参数水质分析仪（YSI Exo 1 multiparameter probe，美国）原位测定地下水温度（T）、pH、氧化还原电位（Eh）、盐度（Sal）、电导率（Cond）和溶解氧（DO）。降水数据和地下水水位数据来自中国科学院常熟农业生态实验站的自动观测数据。

1.3 样品测定

1.3.2 土壤反硝化速率测定 取不同深度的地下水5 L带回实验室，用作培养实验的上覆盖水。将采集好的0～4 m土柱样带回实验室后，将1 m长土层均分为3段，然后将其垂直置于装满原位上覆水的模拟培养装置中，使土样浸没入上覆水中，水面高出土柱6 cm，不盖盖子，预培养8 h，使微生物恢复活性［16］。8 h后分别采集培养罐上覆水水样，测定水中浓度，根据上覆水浓度，加入一定体积100 mg·L-1的硝酸钾溶液，使培养罐上覆水浓度达到5 mg·L-1，然后拧紧盖子，开始进行培养实验，实验室温度调节至地下水年均温度（20℃）。培养体系调试完毕后，立即取第一个水样作为0 h 样品，然后分别在2、4、6、8 h采样，每个样品取三个平行样，取样过程同Li等［9］所述方法。采集好的样品置于4℃冰箱保存，用于测定水中溶解性N2浓度。

1.3.3 水中N2O和溶解性N2浓度测定 地下水中N2O浓度利用顶空取样-气相色谱法测定，具体过程见Terry等［17］所述方法。

利用MIMS（Bay Instruments, Easton, MD，美国）测定水中溶解性N2浓度。例如，MIMS测定N2和Ar的精度分别是小于0.5%、小于0.05%，而测定N2∶Ar（物质的量比）精度小于0.03%。地下水水中N2源于生物过程（主要是反硝化）和物理过程（水气平衡），而Ar溶解度主要受温度、盐度条件控制（纯物理过程）。因此，可通过水样N2∶Ar值计算其真实N2浓度，具体计算过程见Kana等［14］所述方法。

地下水水样带回实验室后过滤（0.45 μm滤膜），用自动化学分析仪（SmartChem 140 discrete auto-analyzer, Westco Scientific Instruments, 美国）测定和浓度，用 TOC（总有机碳）分析仪（N/C 3100 multi-analyzer, Analytik Jena AG, 德国）测定地下水DOC浓度。

1.4 反硝化对地下水NON去除效率的计算

地下水中来自反硝化产生的N2用exN2表示，参照Weymann等［15］所推荐的计算方法。

1.5 数据统计分析

采用Shapiro-Wilk法对所有数据进行正态检验，对不符合正态分布的数据先进行log转化，使其符合正态分布后，再进行统计分析，各参数间的相关性以斯皮尔曼（Spearman）相关系数表示。采用T检验比较不同种植模式及不同深度溶解性N2O和exN2浓度等参数差异显著性，所有统计分析均由SPSS 18.0完成。

2 结 果

2.1 降水量和地下水水位变化

试验期间降水量及地下水位变化如图2所示。2015—2017年的年均降水量为1 410 mm，降水主要集中在夏季，单次最大降水出现在2015年6月17日，降水量高达131 mm。地下水位变化范围为0.12～0.90 m，均值为0.57 m。地下水位主要受降水及灌溉的影响，因此，夏季地下水位通常较低，而秋冬季地下水水位较高。

图2 试验期间降水量和地下水水位变化Fig. 2 Precipitation and groundwater table during the observation period

2.2 三种种植模式下不同深度土壤无机氮含量

2.3 三种种植模式下不同深度地下水NON浓度

图3 农田土壤NON和NHN含量Fig. 3 Soil NON and NHN concentrations in soil profile in paddy field, vegetable field and vineyard

图4 农田地下水NON含量Fig.4 Groundwater NON concentration in soil profile in paddy field, vegetable field and vineyard

2.4 三种种植模式下不同深度土壤反硝化速率

土壤反硝化速率范围为0.16～0.98 μg·g-1·d-1，最高值出现在葡萄园0～1 m土层（图6）。3种种植模式下，土壤反硝化速率随着采样深度增加逐渐降低。0～1 m土层反硝化速率为3～4 m土层的3～5倍。3种农田土壤0～1 m土层反硝化速率差异显著（P＜0.05），至3～4 m土层，反硝化速率已无差异。0～4 m土层反硝化速率的平均值分别为0.30（水稻田）、0.37（蔬菜地）和0.44（葡萄园）μg·g-1·d-1，无显著差异（P＞0.05）。

2.5 地下水中N2O和exN2浓度

3种种植模式下地下水N2O浓度随着采样深度增加逐渐降低（图7），其中，水稻田各深度N2O浓度差异不显著（P＞0.05）。相同深度，N2O浓度由大到小依次为葡萄园、蔬菜地、水稻田。水稻田地下水N2O浓度无明显季节变化，葡萄园和蔬菜地1 m和2 m处地下水N2O浓度存在明显的季节变化和年际差异（图8），高浓度N2O主要出现在春夏季（P＜0.01）。

图5 农田地下水NO3--N含量时间变化规律Fig. 5 Temporal variation of groundwater NO3--N relative to depth and land use type

图6 农田土壤反硝化速率Fig. 6 Soil denitrification rate relative to depth and land use type

地下水exN2浓度由高到低依次为葡萄园、蔬菜地、水稻田，但exN2浓度随采样深度变化不一，其中，水稻田地下水exN2浓度随采样深度而增加，而在葡萄园和蔬菜地，随着采样深度增加，exN2浓度呈现先增（1～2 m）后减（2～4 m）的趋势（图7）。葡萄园和蔬菜地地下水exN2均呈现明显的季节变化，其中高浓度值均出现在春夏季，水稻田地下水exN2浓度季节变化不明显（图8）。

2.6 反硝化对地下水NON的去除效率

3 讨 论

3.1 不同深度土壤及地下水NON浓度

图7 农田地下水N2O和反硝化产应的N2（exN2）浓度Fig. 7 Groundwater N2O and exN2 concentrations relative to depth and land use type

图8 农田地下水N2O和exN2季节变化Fig. 8 Temporal variability of groundwater N2O and exN2 relative to depth and land use type

其次，3种种植模式下，虽然氮肥施用量不存在显著差异，但施肥方式却大为不同。在葡萄园，57%氮肥（340 kg·hm-2）作为基肥在3月份一次性施入，剩余氮肥（250 kg·hm-2）在接下来的4月—6月当作追肥施用。由于葡萄喜欢干旱的土壤环境，葡萄园施肥通常在雨前或灌溉前进行，短时间内（3月—6月）投入大量氮肥，加上太湖地区春夏季多雨的气候加剧了的淋溶，因此，太湖地区果园土壤及表层地下水通常高于菜地和稻田［2-4］。尤其是在3月份，此时葡萄正处于生长恢复期，对营养的需求不旺盛，大量基肥的施用，不但增加了土壤中的累积［19］，有机肥带入的大量有机物质还会促进表层土壤硝化过程，加剧了的淋溶，因此，春季葡萄园地下水远高于其他时期。蔬菜地一般是在播种前施用基肥，蔬菜生长季少量或者不追施氮肥，因此，高浓度均出现在蔬菜播种期。虽然蔬菜地的施肥量与葡萄园相当，但单次施肥量较少（约为120 kg·hm-2），并且蔬菜种植过程中浇水较为频繁，更为湿润的水分条件使得蔬菜地表层土壤反硝化要强于葡萄园，因此，蔬菜地表层土壤及地下水浓度低于葡萄园。

图9 反硝化对地下水NO3--N去除效率（RE）Fig. 9 Removal efficiency of groundwater NO--N by denitrification relative to depth and land use type3

表1 地下水exN2、N2O和RE与各参数之间的相关性（Spearman）Table 1 Spearman correction coefficient and significance matrix between the variables

种植模式的转变还会改变表层土壤的氮素转化过程，王敬等［20］研究表明，太湖地区稻麦轮作农田转变为葡萄园后，提高了土壤硝化速率，导致更多的累积于土壤中。由此可见，太湖地区水稻田改为旱作的葡萄园和蔬菜地，不仅改变了氮肥施用方式，同时也改变了表层土壤氮素转化过程，二者共同作用增加了在表层土壤累积。

与其他研究者在中国华北及西北高氮投入农田的研究结果类似，本研究也发现蔬菜地和葡萄园表层土壤存在累积现象［6］，长三角地区氮肥投入量高，降水量大，加上较低的地下水位（图2），表层累积的极易向下迁移，更易对地下水水质构成威胁，因此，在作物施肥期可观察到地下水浓度急剧上升的现象，但施肥过后，浓度迅速下降，并维持较低值，直至下一次施肥。本研究还发现随着采样深度的增加，土壤及地下水中浓度急剧降低，至4 m处，3种种植模式下土壤和地下水已无差异。可见，虽然长三角地区高氮投入农田如蔬菜地和葡萄园表层土壤浓度非常高，但深层土壤及地下水未出现累积的现象，可能与该地区地下水中存在较强的反硝化作用有关。

3.2 反硝化对NON的去除作用

有研究者认为，与其他高氮投入区相比，长三角地区稻田地下水浓度较低，可能与该地区稻田土壤存在较强的反硝化作用有关［7］。例如，Bu等［10］利用消失法发现太湖地区农田缓冲带能消减67.5%～88% 地下水同时伴随着δ15N-升高，据此推断反硝化是消除地下水的主要机制。但由于研究方法的限制，已有的研究仅能证明反硝化的发生，无法量化其对的去除效率［10-11］。本研究利用N2直接定量法，首次量化了反硝化对地下水的去除效率，在0～4 m的剖面范围内，3种种植模式下反硝化对去除效率（RE）分别为65%、83%和76%。

3.3 地下水反硝化的影响因素

根据化学计量法测算，1 mg DOC可消耗0.93 mg据此测算，本研究中地下水DOC含量足够反硝化微生物所需，理论上去除效率应当接近100%，但实际去除率仅有65%～83%。有研究发现地下水DOC含量仅为2 mg·L-1时，反硝化对地下水的去除率（88%～95%）却高于本研究［26-28］。本研究也发现，虽然葡萄园地下水中DOC含量高于蔬菜地，但去除效率却低于蔬菜地（图9），这说明地下水中DOC含量高并不表示反硝化活性也高。Siemens等［29］认为地下水中反硝化微生物仅能利用来自作物根系分泌的有机物质，来自表层土壤分解产生的DOC难以被微生物利用。还有研究发现，土壤和沉积物反硝化速率与DOC含量相关性并不显著，而与颗粒态有机碳含量关系密切［30］。此外，不同种植模式下，根系深浅及根系分泌物种类存在差异，也会影响地下水反硝化过程［31］。这说明与浓度高低相比，DOC的生物有效性对地下水反硝化活性更为重要。

土壤类型也是影响反硝化活性的重要因素。本研究区域表层土壤多为壤质黏土，部分深层次土壤（2～3 m）为黏壤土。由于土壤黏粒含量高，造成土壤饱和导水率较低，随水运移速度较慢，增加了反硝化进行的时间，有利于反硝化对的去除［8］。

图10 硝酸盐去除率（RE）与地下水NON、DO和DOC的相关性Fig. 10 Correlation of RE with NON, DO and DOC concentration in groundwater

3.4 地下水反硝化对区域氮素平衡的影响

图11 不同深度地下水中各形态氮浓度Fig. 11 Mean concentrations of exN2, NHN, NON and N2O in groundwater relative to depth and land use type

Fox等［13］将以溶解性气态氮形式损失的氮定义为“消失的氮（Missing nitrogen）”，认为这一部分氮对于评估区域氮素平衡十分重要。Gardner等［28］利用经验模型估算了一个小流域氮素的各种去向，发现如果将“消失的氮”纳入其中，将极大地提高模型的准确度。就本研究而言，在葡萄园和蔬菜地，65%～83%地下水被反硝化所消耗，以exN2的形式存在于地下水。鉴于淋溶损失是太湖地区旱作农业氮素最大的损失途径（12%～20%）［32］，由地下水反硝化造成的气态氮素流失也将非常可观，但现有的研究在计算氮素淋溶损失时，测定的地下水实际是经反硝化消耗后残留的并非初始浓度，因而会低估淋溶损失量［30］。

朱兆良［33］曾对我国农田化肥氮去向进行了评估，认为有13%的氮素去向不明，以溶解性气态氮流失的氮可能就是尚不明确的去向之一。对于淋溶损失严重的果园和蔬菜地，明确“消失的氮”的量将有助于区域氮素损失的准确估算。N2直接定量法通过exN2浓度反推地下水初始浓度，有助于更为准确估算淋溶损失量［28］。

4 结 论