付俊文，何雪铼，侯能易，熊海波，庞明辉，

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院胃肠外科，四川 成都 610072)

当前结直肠癌是最常见的癌症之一。我国在2015年新增的结直肠癌患者高达37.6万，而死于该病的患者达19.1万[1]。美国癌症协会报道近十年来美国结直肠癌的总体发病率和死亡率略呈下降趋势，但在低于50岁人群中的发病率增加了22%[2]。目前大量的研究发现许多基因和分子水平异常表达对结直肠癌的诊断、治疗及预后判断具有重要价值。

瞬时受体电位香草酸亚型 1(TRPV1)属于瞬时感受器电位(TRP)离子通道家族，由于其能被辣椒素激活，也称为辣椒素受体，是一种非选择性阳离子配体门控通道[3，4]。由于它在传入感觉神经元中占主导地位，TRPV1被认为是对热、机械和化学刺激反应的关键传感器[5]。与此同时，TRPV1也与机体的新陈代谢、长寿、炎症和癌症有很大的关系[6～9]。TRPV1与肿瘤关系密切，包括乳腺癌[10，11]，肝癌[12]，舌鳞状细胞癌[13]，前列腺癌[14，15]，胰腺癌[16]，Vinuesa等[17]对结肠炎相关癌症模型小鼠研究发现，结肠癌中TRPV1在肠道中有免疫调节作用，影响肠黏膜中炎性细胞的活性，从而改变肿瘤微环境，抑制结肠癌的发生和发展。Petrus等[18]在多发性肠道肿瘤的小鼠模型中研究发现肠上皮细胞中的内源性TRPV1表达可能直接影响生长因子受体信号传导，并抑制肿瘤形成。

然而TRPV1在人结肠癌和癌旁、正常组织的差异表达及其与人结直肠癌发生发展的相关性未见报道。因此，我们在前期通过TCGA数据库分析TRPV1在结肠癌组织和正常组织中存在差异表达的基础上，收集临床标本，通过免疫组织化学的方法验证肿瘤组织、癌旁组织以及正常组织的TRPV1蛋白表达，并进一步在结肠癌细胞系中探索TRPV1导致的癌细胞的生物学行为变化。

1 资料与方法

1.1一般资料收集四川省人民医院胃肠外科2018年5～8月行结肠癌根治性手术的肿瘤标本10例、距肿瘤边缘0.5 cm的癌旁组织10例，距肿瘤边缘5 cm以上的正常结肠组织6例，所有的肿瘤组织最后经病理检查证实为原发性结肠癌。人结肠癌细胞系HCT116来自中国科学院上海生命科学研究院(中国上海)。

1.2方法

1.2.1在石蜡包埋的组织切片上进行免疫组织化学分析 在室温下使用3%过氧化氢进行抗原修复15分钟。随后，将切片与适当的一抗TRPV1(Cell Signaling Technology，MA，USA)在4 ℃温育过夜。在37 ℃培养箱中再加热30分钟后，将切片与适量的生物素化山羊抗兔IgG在37 ℃下孵育30分钟。使用SABC-POD试剂盒(北京华尔光伏科技有限公司，中国北京)进行TRPV1免疫组织化学染色，然后用苏木精复染。采用PBS代替一抗作为阴性对照组。通过使用Nikon计算机图像系统(Nikon，Tokyo，Japan)随机选择每个部分中的总共五个视野(放大倍数，×400)，然后使用Image-Pro Plus软件评估免疫反应性区域。

1.2.2细胞活力测定 人结直肠癌细胞系HCT116获自中国科学院上海生命科学研究院(中国上海)。将HCT116细胞在补充有10%胎牛血清(FBS；Gibco，CA，USA)的DMEM培养基中培养，在37 ℃，5%CO2中温育。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8；Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)测定法测定细胞活力。将每孔约7×103个细胞接种在96孔板中。孵育后，原始培养基为取出并将100 μl新鲜培养基与CCK-8以10∶1的比例混合，在37 ℃下向各孔中加入30分钟。通过酶标仪(Bio-Rad，CA，USA)在450 nm下测量吸光度值。

1.2.3Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测 使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)检测细胞凋亡。在收集凋亡物之前，将HCT116细胞与辣椒素一起温育。收集细胞并重悬于含有5 μl膜联蛋白A5-绿色荧光素和5 μl氧化丙啶(BD Biosciences，Franklin Lakes，CA，USA)的100 μl结合缓冲液(1×105个细胞)中，并在室温(20～25 ℃)下孵育。在黑暗中持续15分钟。使用FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences)在1小时内检测细胞凋亡。

1.3统计学方法使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差表示。通过方差分析(ANOVA)与Dunnett-t检验比较两组之间的差异。所有方差分析数据均通过方差齐性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TRPV1在TCGA数据库结肠癌样本和正常组织样本中的表达在TCGA数据库中共收录结肠癌组织275例，正常组织349例。发现TRPV1在结肠癌组织中的表达明显低于在正常组织中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。如图1。

图1 TRPV1在结肠癌组织和正常组织中的表达 TRPV1在结肠癌组织(左侧深灰色)中的表达明显低于在结肠正常组织中的表达(右侧浅灰色)

2.2TRPV1在结肠癌组织中的表达如图2所示，与正常组织相比，TRPV1的蛋白表达水平在结肠癌组织和癌旁组织中较低。与癌旁组织相比，肿瘤组织中TRPV1的蛋白表达水平显着降低。表明在结肠癌中TRPV1表达显著降低，提示TRPV1在结肠癌的发生发展中可能起抑制作用，是肿瘤的抑制因子。

图2 TRPV1的蛋白表达水平 a：400镜下组织免疫组织蛋白表达；b：TRPV1蛋白相对表达量 TRPV1的表达变化(肿瘤组织n=10，癌旁组织n=10，正常组织n=6)，与正常组相比，* P <0.05和** P <0.01，## P <0.01

2.3体外细胞实验结果表明，与结肠癌细胞系HCT116未做任何处理相比，辣椒素处理激动TRPV1后显著抑制结肠癌细胞的增殖能力，并且能够诱导细胞凋亡。用CCK-8检测辣椒素处理后的结肠癌细胞活力，与未经指定处理的结肠癌细胞作对照(结果如图3)，TRPV1激活后，结肠癌HCT116细胞增殖能力显著降低(P<0.01)。继续用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检验处理后结肠癌细胞的凋亡情况，与未经指定处理的结肠癌细胞作对照，结果发现(如图4)，经辣椒素处理后，结肠癌HCT116细胞凋亡增多，表明TRPV1能够促进结肠癌细胞凋亡。

图3 CCK-8测定法测定细胞活力

图4 细胞凋亡情况 a：流式细胞学术检测细胞凋亡；b：条形图凋亡率

3 讨论

TRPV1分布广泛，在多种细胞类型中普遍表达[19]。在肠道中，TRPV1调节如运动，分泌，循环和内脏伤害感受等生理功能[20～22]。我们的研究揭示并验证了TRPV1蛋白在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织和正常组织，在癌旁组织中的表达显著低于正常组织，说明TRPV1可能作为肿瘤的抑制因子发挥作用。进一步，我们在结肠癌细胞系中验证了TRPV1的生物学功能，发现它有抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的特点。

TRPV1在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，TRPV1(以及TRPV4)离子通道在肝母细胞瘤HepG2细胞中介导Ca2+转运[12]，被认为与肿瘤细胞迁移相关[23]。有学者在对MCF-7乳腺癌细胞系的研究中发现，上调或下调TRPV1均可诱导细胞生长的抑制，但其机制还有待阐明[11]。在前列腺癌研究中，α1D肾上腺素能受体和TRPV1(升高)之间的串扰能够促进细胞增殖，表明了靶向α1D-AR和TRPV1通道治疗前列腺癌的可能性[15]。也有文献报道[17]，TRPV1 在肠道中具有免疫调节功能，其C感觉神经元释放神经肽，如血管活性肠肽(VIP)和垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)(免疫功能调节剂[24])，这些神经肽通过影响肠粘膜中炎性细胞的活性，导致促炎细胞因子的释放减少，进而使转录激活因子3(STAT3)和核因子kappaB(NF-kB)驱动的上皮肿瘤发生的风险降低，从而抑制结肠癌的发生与发展。还有报道[18]显示TRPV1离子通道在Ca2+/钙蛋白酶介导的磷酸酶活性调节肠上皮中的表皮生长因子受体(EGFR)信号传导中起重要作用，有助于预防肠道肿瘤发生。我们在结肠细胞实验中发现，TRPV1的活化导致HCT116细胞系增殖能力下降、凋亡显著增多。我们证实了TRPV1在结肠癌中的差异表达，对其在结肠癌细胞中的生长抑制作用做了初步探讨，阐述了TRPV1作为抑癌基因影响肿瘤生长，为临床将其作为结肠癌诊断标志物提供了证据。遗憾的是，我们没有对TRPV1介导结肠癌细胞凋亡的机制进行深入探讨，这是课题组下一步工作的重点，我们将系统挖掘TRPV1在结肠癌发生发展中的作用机制。