金 苹，吴方评

（湖南医药学院·侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000）

湖南省怀化市靖州苗族侗族自治县是全国茯苓的主要集散地，茯苓也是怀化特色的“药食同源”中药。茯苓为中药配伍常用药，其三萜类成分对肺癌等恶性肿瘤作用明显[1-5]。但靖州茯苓三萜类成分对A549细胞中核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路的影响鲜有报道。人醌NADH脱氢酶1（NQO1）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）等是Nrf2信号通路的下游基因，两者的活力和蛋白表达水平可反映Nrf2信号通路激活情况[6-10]。本研究中通过体外试验研究靖州茯苓三萜类成分对A549细胞增殖及其细胞中Nrf2，NQO1，GST蛋白表达水平的影响，以此探讨三萜类成分抑制肺癌细胞扩散的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药与仪器

细胞：A549细胞（ATCC），购自中国科学院上海细胞库。

试药：靖州茯苓（批号为20150701），购自怀化龙源药业有限公司，经湖南医药学院邓伟峰教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；RPMI 1640培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）；RIPA细胞裂解液（编号P0013C）、丽春红染料（编号P0022），均购自碧云天生物技术研究所；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，南京化学试剂有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司）。

仪器：ClassⅡBiosafety Cabinet生物安全柜（美国Labconco公司）；HERA CELL 500型 CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；酶标仪、电泳仪（美国Bio-Rad公司）；LC-350型超声波清洗仪（山东济宁鲁超超声设备有限公司）；Nikon Eclipse TS100型倒置显微镜（日本尼康公司）；ZW-A型微量振荡器（常州国华电器有限公司）；LDZX-50K型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；5430R冷冻离心机（德国艾本德公司）；AL204型电子分析天平，Nanodrop 1000型微量紫外分光光度计（瑞士Mettler Toledo公司）；HH-60型数显恒温搅拌循环水浴锅（常州国华电器有限公司）；JB50-D型增力电动搅拌机（上海标本模型厂）。

1.2 方法

1.2.1 三萜提取物制备

取药材样品，去杂质，置50℃烘箱中，3 h烘干，取出干燥后的药材样品，粉碎，过4号筛，取粉末10 g，用20倍质量乙酸乙酯提取3次，每次提取30 min，3层纱布滤过，合并滤液，回收溶剂，烘干，即得靖州茯苓三萜[11]。

1.2.2 噻唑盐比色（MTT）法检测细胞存活率

取对数生长期A549细胞，加胰酶消化2 min，再加入含10%小牛血清的DMEM不完全高糖培养液，终止消化，并吹打细胞，使细胞全部进入培养基，离心，倒掉含有胰酶的上清液，重新加入上述培养基制成细胞悬液，调整细胞密度，接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μL。将接种好的96孔板放入细胞培养箱中培养24 h，去除孔内原有的培养基，每孔加入用空白培养基稀释过的茯苓三萜溶液，使其质量浓度分别为500，250，125，62，31，15，7.5，3.75 μg/mL，设为茯苓三萜 1 ～8 组，另设阳性对照组（顺铂，质量浓度为10 μg/mL）和空白对照组，每个质量浓度设置6个复孔，然后继续放入细胞培养箱中培养24 h，去除培养基，每孔加入100 μL含10%MTT的空白培养基（5 mg/mL MTT），继续培养4 h后终止，去除孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，将96孔板置微量振荡仪上振摇10 min，待结晶充分溶解后放入酶标仪，测定吸光度值（A），检测波长为470，590 nm，重复3次，并按下式计算细胞生长抑制率 [半抑制质量浓度（IC50）为 109.9 μg/mL] 。

1.2.3 Westernblot法检测 Nrf2，GST，NQO1的蛋白表达

以含10%胎牛血清的1640 DMEM培养液，于5%CO2、37℃的培养箱中培养A549细胞，每天换培养基1次，隔天传代1次，取对数生长期细胞并调整细胞密度，接种于6孔板中，继续培养24 h，加入质量浓度为30，60，90，120 μg/mL的茯苓三萜溶液继续培养24 h。弃原上清液，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，每孔加入细胞裂解液 200 μL，冰上裂解 30 min，4 ℃下 13 000 r/min 离心5 min，收集细胞裂解液。

细胞裂解液煮沸变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，灌制5%浓缩胶，10%分离胶，上样20 μL，浓缩胶电压为85 V，时间为30 min，分离胶电压为120 V，时间为80 min，待溴酚蓝到达距离胶底部约0.5 cm处即停止电泳，胶带放入转移缓冲液中浸泡15 min（湿法电转）。然后恒流 200 mA，转印 90 min，将蛋白从 SDSPAGE凝胶上转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用丽春红染色，牛血清白蛋白（BSA）封闭后加入抗Nrf2（稀释比 1 ∶600，货号 ab31163）、GST（稀释比 1 ∶700，货号 ab153949）、NQO1（稀释比 1 ∶650，货号 ab34173）、β-actin（稀释比 1 ∶3 000，货号 ab16039）4 ℃ 孵育过夜，最后加入二抗（稀释比1∶3 000，货号ab6789）孵育2 h，室温振摇1 h，回收二抗，洗3次，加入ECL化学发光试剂，显影，定影，清洗。将条带灰度值数字化。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 A549细胞存活率

作用24h内，当茯苓三萜溶液质量浓度大于15μg/mL时，A549细胞存活率开始降低，且随质量浓度升高而显著下降；当茯苓三萜质量浓度为250 μg/mL时，A549细胞存活率与阳性对照组基本持平。结果表明，靖州茯苓三萜质量浓度大于250 μg/mL时对A549细胞的增殖具有抑制作用，其IC50=109.9 μg/mL。结果见表1和图1。

表1 茯苓三萜类成分对A549细胞存活率的影响

图1 茯苓三萜类成分对A549细胞存活率的影响

2.2 Nrf2，GST，NQO1 蛋白表达水平

当茯苓三萜溶液质量浓度为30 μg/mL时，A549细胞中Nrf2，GST，NQO1的蛋白表达水平与空白对照组相比均显著升高（P<0.05）。随质量浓度的进一步增加，Nrf2，GST，NQO1的蛋白表达水平也升高，且具有剂量依赖性。结果表明，茯苓三萜对A549细胞中Nrf2信号通路具有调控作用。将其结果进行灰度扫描（n=3）和统计学分析，结果见图2和图3。

图2 茯苓三萜类成分对A549细胞中Nrf2，GST，NQO1蛋白表达水平的影响

图3 Western blot灰度扫描结果（n=3）

3 讨论

茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，为我国常用中草药，有利水消肿、健脾、渗湿、宁心等功效，为中药配伍常用药，目前已知的以其原料配伍的中成药超过300种。茯苓的化学成分主要有多糖、三萜类化合物（茯苓素、茯苓酸）等[12]。仲兆金等[13]从茯苓中分离得到三萜类成分及其衍生物，并发现其对人慢性髓样白血病细胞（K562细胞）具有明显抑制作用，可影响小鼠T淋巴细胞的增殖。茯苓所含三萜类成分有调节免疫功能、抗肿瘤、抗炎等作用，并可诱导人白血病细胞系HL-60细胞的分化，且对肺癌、卵巢癌、子宫肌瘤、皮肤癌、直肠癌、中枢神经癌等作用明显[1-5]，是茯苓的重要有效成分。还有研究表明，茯苓素对艾氏腹水瘤、白血病L1210、肉瘤S180细胞有显著抑制作用，对小鼠Lewis肺癌的转移也有一定抑制作用[1，13]。

肺癌在许多国家和地区的发病率不断升高，已超过肝癌，成为致死率最高的肿瘤。以浙江省乐清市为例，2012年至2015年恶性肿瘤年平均发病率为248.85/10万[14]。A549细胞为非小细胞肺癌细胞系。A549细胞模型是目前国内外研究肺癌的主要细胞模型。肺癌的发生和恶化受到多种因素的影响，其中Nrf2信号通路和其下游基因GST和NQO1为关键的影响因素。NQO1将醌类等异源性物质还原为氢醌，继而被结合排出，避免醌类物质转化为半醌类，从而达到保护细胞的作用。GST催化GSH与亲电子物质结合，最终形成硫醚氨酸排出体外，在解毒功能上起着重要作用。Nrf2-ARE信号通路和预防肺癌发生及其恶化密切相关，其本身和其下游基因GST和NQO1蛋白表达水平可反映Nrf2-ARE信号通路被激活的情况。在本试验中，靖州茯苓三萜类成分可引起A549细胞的氧化应激性，启动自我防护机制，具体表现为提高Nrf2，GST，NQO1蛋白表达水平，继而增强Ⅱ相解毒酶GST和NQO1的活力，说明靖州茯苓三萜类成分可通过抑制Nrf2-ARE信号通路而延长早期肺癌向晚期肺癌的转移时程。