万铁林，冯广帅

(安阳市第五人民医院，河南 安阳 455000)

肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌主要为肝细胞癌(HCC)，其病因及确切分子机制尚不完全清楚[1]，近年来肝癌的基础研究不断取得新的进展[2－4]，但发病率和病死率仍呈逐年升高趋势[5]，中国肝癌的发病率和死亡率位于世界较高水平[6，7]。而在我国感染乙型肝炎病毒是肝癌发病的主要原因，我国肝癌患者中的乙型肝炎病毒感染率约占90%[8，9]，乙型肝炎病毒X蛋白是引起HCC最主要的原因，乙型肝炎相关性发病机制复杂，目前尚无特效的治疗性药物。因此，探索新的治疗靶点是目前治疗乙型肝炎相关性的关键所在[10]。

随着精准医学时代的到来，我们认识到HCC的发生发展是多基因相互作用的过程，同时涉及多种细胞信号转导通路。异黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，它调节着众多信号通路，在促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭中发挥重要作用。而人类Wnt基因家族由19个家族成员组成[11]，Wnt信号通路主要参与各种内环境稳态的维持以及胚胎的正常发育过程，在众多恶性肿瘤中，MTDH基因和Wnt5b的表达上调，如乳腺癌、膀胱癌等。然而，一直未有MTDH和Wnt5b在HCC组织中表达情况及作用机制的系统研究。

本研究探讨了乙肝相关性HCC组织中MTDH及Wnt5b表达与患者临床病理特征的关系，同时检测了乙肝相关性HCC组织中MTDH mRNA及Wnt5b mRNA的表达情况，为今后研究MTDH和Wnt5b在肝癌发生、发展中的信号传导机制提供实验论证。

1 材料与方法

1.1.1 材料 总RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物有限公司），逆转录试剂盒 （购自大连Takara生物有限公司），免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒，兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体（购自美国Abcam 公司），山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP（PV－6000）（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人甘油醛－3－磷酸脱氢酶单克隆抗体及鼠抗兔单克隆二抗（均购自武汉博士德生物有限公司），一抗稀释液（P0103）（购自上海碧云天生物技术有限公司），PCR引物为上海生工生物公司合成，其它试剂为国产分析纯试剂。紫外分光光度计(日本HITACHI)，PCR仪 (美国ABI公司)， 显微镜 （德国Kruess公司）。

1.1.2 标本来源 肝癌患者知情，同意外科手术后，取肿瘤组织，其中男29例、女25例；另收集2例外伤致肝破裂切除的部分组织作为正常组织。将标本均分为两组，一组用于组织提取，在液氮中冰冻保存，另一组则加入多聚甲醛，在室温下固定，流水漂洗后，室温过夜，包埋，零下保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 标本用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，切片厚度为4μm，在65℃下烘烤2h，用二甲苯脱蜡60min，水化用梯度酒精，低温微波修复抗原10min，将其冷却至室温，再加入3%过氧化氢浸染20min，然后加入1%BSA封闭30min，一抗4℃孵育过夜，用PBS溶液洗3次，每次2min，次日加入二抗室温孵育30min，加入DAB显色，水洗充分后，再用苏木素染核10min，紧接着1%盐酸酒精进行分化，加氨水蓝化，用乙醇梯度脱水，二甲苯使透明，最后封片。

1.2.2 组织总RNA抽提 分别取已经冻存于液氮罐的乙肝相关性HCC组织，提取RNA（操作按试剂盒说明书进行）。用紫外分光光度计测定总RNA纯度和含量，在260nm和280nm处的紫外吸光度值比值在 2.0±0.1 之间。 取 RNA 2μg进行逆转录，操作过程按试剂盒说明和相关文献[12]进行，PCR实验中所使用的引物见表1。

表1 RT-PCR中使用的引物

2 结果

2.1 MTDH和Wnt5b在乙肝相关性肝癌组织的表达及相关性 免疫组化检测MTDH和Wnt5b在乙肝相关性肝癌组织中均有表达，54例乙肝相关性肝癌组织中MTDH表达阳性率为77.78%，Wnt5b表达的阳性率为70.37%，采用SPSS 17.0进行统计处理，统计分析发现，MTDH及Wnt5b表达阳性与患者的年龄、性别、无相关性，但与肿瘤直径显著相关（P＜0.05），见表 2。

2.2 乙肝相关性肝癌组织中MTDH和Wnt5b表达的临床病理学特征 通过对54例确诊肝癌病例肝组织、2例正常肝脏对照组织进行免疫组化检测，结果表明肝癌组织有MTDH和Wnt5b表达，且肝癌组织中MTDH明显高于正常肝脏组织，正常肝脏组织中几乎未发现明显的MTDH表达，而正常肝脏组织中的Wnt5b的表达明显高于肝癌组织，显微镜下见乙肝相关性HCC组织中MTDH主要表达于胞浆，部分表达于细胞核，而Wnt5b表达主要在细胞核。见图1。

表2 MTDH和Wnt5b在乙肝相关性肝癌组织的表达

图1 免疫组化检测MTDH及Wnt5b在肝癌组织中的表达(×200)

2.3 RNA提取及逆转录PCR检测 对正常肝脏组织和肝癌组织应用RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA，并利用RT－PCR检测MTDH、Wnt5b的mRNA相对表达量，我们发现肝癌组织中MTDH mRNA表达明显高于正常肝脏组织，但肝癌组织Wnt5b mRNA的表达却低于正常的肝脏组织，见图2。

3 讨论

图2 不同肝脏组织中MTDH和Wnt5b mRNA表达水平

目前关于HCC发生机制表明，肝炎病毒感染（如乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒）及毒素（如黄曲霉毒素）或代谢等致病因素导致组织损伤后形成肝硬化和因为HCC中的癌基因或肿瘤抑制基因是占主导地位的两种主要致病机制，两者均与几种重要的细胞信号传导途径的异常激活相关[13]，乙型肝炎病毒感染是肝细胞肝癌的首要致病因素，预防肝癌的最有效方法是将乙肝的病毒，载量控制在正常范围，随着近年来靶向治疗技术的迅猛发展，已证实靶向作用于信号传导通路中的关键基因有助于逆转、延迟或阻止肿瘤发生[14]。而对于已确诊的乙肝相关性肝癌患者是否有必要进行分子靶向药物治疗还有待研究。因此，探索HCC演进的分子机制及寻求其演进过程中潜在的治疗靶点无疑具有十分重要临床意义。

癌基因、抑癌基因在肿瘤发生的不同阶段会出现不同的功能异常，是一个不同的信号转导通路分子的多基因参与调控的复杂过程。如今发现参与了HCC的发生和进展过程的基因多达数十种，而MTDH和Wnt5b是近几年发现了一些与HCC相关的新基因。MTDH是个高度保守的基因，近年的研究显示，MTDH在多种人类肿瘤中过表达，是在人免疫缺陷病毒1感染或肿瘤坏死因子α处理过的人原始胚胎星形胶质细胞中表达升高的基因，检测其表达程度有助于对HCC在临床上进行早期诊断，MTDH对肿瘤来说是一个有效的评估预后的生物学标志物，参与多个重要的信号调控通路，这其中包括三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及转录激活蛋白-1（AP-1）等信号通路[15]，它们在促进肿瘤细胞的增殖、转移侵袭中发挥重要作用，例如Haras、NF-κB 和 Wnt/β-catenin。 MTDH 异常表达可导致肿瘤细胞的异常增殖、凋亡耐受、侵袭转移、新生血管形成等，而它的具体调控机制则涉及多个信号转导途径和分子表达，但其致瘤机制并不完全明了，它可能是一个潜在的癌基因，而HBV感染可能是MTDH异常表达的一个始动因素。Wnt信号通路是一条在进化上极其保守的信号传导途径，Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，目前研究较多的是经典Wnt/βcatenin信号传导通路，研究发现它在胚胎发育、组织再生、造血、细胞增殖分化与迁移等过程和功能中发挥的作用十分关键[16]，在许多组织和器官干细胞的分化和更新过程中起到重要的介导作用[17，19]。国内HCC中Wnt信号传导通路的研究目前主要集中于对其上游和或下游个别基因异常表达的探讨，Wnt信号通路的异常激活已被证实与包括HCC在内多种肿瘤发生发展密切相关[18]。在家族成员中，Wnt5b作为Wnt通路众多配体之一，Wnt5b参与了上皮细胞向间质细胞的转化，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力。

在本研究中，我们通过收集肝癌组织和正常组织分别检测MTDH和Wnt5b的表达水平，在对正常肝脏组织和肝癌组织进行免疫组化和PCR扩增时，正常组织和肝癌组织中MTDH都有一定量的表达，但正常组织的表达明显低于肝癌组，与周文波[12]发现正常的肝脏组织Wnt5b的表达比癌旁组织和肝癌组织要高相吻合。这一现象可能与肝癌的发生过程中激发了多个信号通路有关，从而使这一潜在的癌基因得以扩增及转移，但这一癌基因是如何被激发的，有哪些信号通路得以表达仍需要作进一步检测。在证实MTDH在HBV相关肝细胞癌组织中高表达的同时，Wnt5b在HBV相关肝细胞癌组织中低表达，正常组织中的Wnt5b表达明显高于肝癌组织，在某种程度上，我们可以认为它对肝癌的细胞的异常增殖、迁移起到阻止作用，而这种阻止行为在某种程度上引起自身的消亡。实验中我们还发现MTDH和Wnt5b的表达水平还与肿瘤直径密切相关，这一发现与陶鹏辉[10]认为的MTDH和乙型肝炎HCC中的表达与患者年龄、性别无相关性，但与肿瘤直径存在相关性相一致，但这种相关性与MTDH和Wnt5b两者之间的表达量是否有直接关系，未有证实。我们知道HBV病毒HBX蛋白在HBV相关性HCC的发生中起关键性的作用，该蛋白广泛参与了RAS/RAF/MAPK、Wnt/β -catenin、PI3K/AKT/ERK、JAK/STAT等信号通路及其下游分子 cyclin D、A、B、P21 cip1、GSK-3β等的功能调控[20]。所有这些结果均提示我们MTDH和Wnt5b可以被用来对HBV相关性HCC进行早期诊断、准确分期诊断，它们作为两个新的生物学标志物，对患者用药提供参考，MTDH与Wnt5b的表达存在明显不同，但MTDH和Wnt5b与HBV病毒之间的关系依然不明了，在MTDH异常增殖时，Wnt5b是否起到保护及延缓肝癌细胞的扩增，迁移，在此次研究中还未得到相关的实验论证，这需要作进一步的后续研究。