毕春艳，薛剑桥，翟兆玲

（淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

退黄保肝胶囊是由赤芍、茵陈、白术、枳壳、栀子、郁金、丹参、金钱草等十五味药组成，有疏肝健脾，清利湿热，利胆退黄的作用，用于急慢性黄疸型肝炎。方中茵陈为君药，具有清利湿热，利胆退黄[1]的功效，其中绿原酸为其主要成分之一。现代研究表明绿原酸是一类分布广泛且有诸多药理作用的天然化合物，具有抗氧化、抗菌、抗突变和抗癌变、降血脂和降血压、保护心血管和中枢神经、抑制糖尿病、抗紫外和抗辐射、抗白血病、免疫调节、细胞保护、保肝、抗内毒素、抗抑郁和焦虑等多方面的药理作用[2]。枳壳为臣药，现代研究表明，枳壳主要含黄酮、生物碱、挥发油等化学成分，且具有广泛的药理作用，常作为理气药，对脂肪肝引起的转氨酶升高和肝内脂肪浸润、肥胖、高脂血症进行治疗和调理[3]。枳壳的药典主要质控成分为柚皮苷和新橙皮苷[1]。为提高退黄保肝胶囊的质量标准，保障临床用药安全，本文采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定该制剂中绿原酸、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），配备SPD-20A UV/VIS检测器、LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒温水浴锅（上海一恒公司）。

1.2 材料

绿原酸对照品（批号110753-201415，含量以96.2%计），柚皮苷对照品（批号110722-201613，含量以94.3%计），新橙皮苷对照品（批号111857-201102，含量以99.6%计），均购自中国食品药品检定研究院；退黄保肝胶囊3批，批号分别为170318，170412，170521，均为医院制剂；液相用乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为InertSustain C18Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）；流速为1.0 ml/min；检测波长为283 nm；柱温为35 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作为对照品储备溶液。临用时，精密吸取上述3种对照品储备溶液各1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，称定重量，加热回流60 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按照退黄保肝胶囊处方制备不含茵陈、枳壳的样品，按2.2.2项方法操作，制得阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别精密吸取2.2项下3种溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图。结果表明，供试品呈现与对照品保留时间一致的色谱峰，阴性样品在对照品的保留时间处，无色谱峰干扰（见图1）。

图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下对照品溶液1，5，10，20，30 μl，注入高效液相色谱仪，依法测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得绿原酸回归方程为Y=2×106X-523，r=0.9999，柚皮苷回归方程为Y=2×106X+388，r=0.9999，新橙皮苷回归方程为Y=2×106X+436，r=0.9996，结果表明，绿原酸在0.0387～1.1610 μg、柚皮苷在0.0399～1.1970 μg、新橙皮苷在0.0414～1.2420 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取2.2.1项下对照品溶液10 μl，重复进样6次，记录峰面积。结果绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.41%，0.35%，0.36%（n=6）。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批（批号为170318）样品，按2.2.2项方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项色谱条件测定。结果，绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷平均含量分别为1.3398，1.8978，2.2241 mg/g，RSD分别为0.9%，1.0%，1.2%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一批（批号为170318）样品，按2.2.2项方法制备供试品溶液，分别于0，6，9，12，18，21，24 h按规定的色谱条件测定峰面积。结果绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.19%，0.31%，0.27%（n=7），表明供试品溶液在24 h内质量稳定性。

2.8 加样回收试验

分别取同一批已知含量的样品（批号为170318）约0.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入绿原酸对照品储备溶液、柚皮苷对照品储备溶液、新橙皮苷对照品储备溶液3，5，5 ml，挥干甲醇，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算加样回收率。结果绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为99.7%，99.3%，99.6%，RSD分别为0.9%，1.3%，1.1%（n=6）。

2.9 样品含量测定

取3批样品（批号分别为170318，170412，170521），分别按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算各成分含量，结果见表1。

表1 供试品中绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷含量测定（n=3）

3 讨论

3.1 波长的选择

分别取绿原酸、柚皮苷、新橙皮苷对照品溶液在200～500 nm波长范围内扫描，最大吸收波长分别为327，283，283 nm，因在283 nm得到的峰形、峰高最为适宜，故选用283 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

对比了乙腈-0.4%磷酸溶液（13:87）[1]，乙腈-0.1%磷酸溶液（10:90）[4]，乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）[5]，乙腈-水（20:80）[6]，乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（16:10:74）[7]的分离效果，结果表明以乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）为流动相时，样品中各组分的分离度最好，故采用乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）为流动相。

3.3 提取溶剂和提取时间的确定

分别考察了以50%甲醇[7]、70%甲醇、75%甲醇[8]、甲醇[6]、50%乙醇、70% 乙醇[9]、 90%乙醇、乙醇为溶剂的加热回流提取效果，结果表明70%甲醇提取效果优于其他溶剂。同时对提取时间进行了考察，结果表明加热回流60 min能提取完全，故确定用70%甲醇加热回流提取60 min。