任泽文 肖志红 吴 红 张爱华 赵梦瑞 彭映辉 黎继烈

(中南林业科技大学生物技术湖南省重点实验室1，长沙 410004) (湖南省林业科学院2，长沙 410004) (湖南粮食集团有限责任公司3，长沙 410083) (南开大学化学院4，天津 300071)

油茶(Camelliaoieifera)，山茶科山茶属，为常绿小乔木或灌木，是我国南方主要的一种木本食用油料树种[1]。油茶加工后产生了大量的油茶饼粕，未能得到充分的利用[2]。油茶饼粕营养丰富，蛋白质质量分数大于15%，适合作为微生物发酵的基质[3-5]。油茶饼粕中的茶皂素质量分数一般在15%～25%，还存在少许的单宁、植酸等抗营养成分，导致其在饲料方面的应用受到一定的限制[6]。因此，寻求一种高效、安全的降解油茶饼粕中茶皂素的新方法尤为重要。利用微生物降解油茶饼粕中的茶皂素具有安全、高效、环保的优点，因此越来越受到研究人员的关注。目前，国内已有部分细菌和真菌被应用于茶皂素的降解研究上，如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)等菌种，降解率在60%～75%之间[7-11]。本研究旨在筛选到能够更高效降解茶皂素的菌株，探究其固态发酵降解油茶饼粕中茶皂素的条件，为提高油茶饼粕的利用提供参考。

1 材料与方法

1. 1 材料

油茶饼粕：湖南省林业科学院提供，105 ℃烘干粉碎后过40目筛，茶皂素含量为13.8%；

1.1.1 培养基

真菌分离培养基[12]：葡萄糖2%,琼脂2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，链霉素30μg/mL，pH自然。

PDA培养基：去皮马铃薯200 g, 葡萄糖20 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1 000 mL,pH自然。

PDA液体培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然(添加20颗小玻璃珠)。

油茶饼粕发酵培养基：30 g油茶饼粕，24 mL蒸馏水，pH自然。做法：30 g油茶饼粕添加24 mL蒸馏水在不锈钢盆子里拌匀并覆盖一层保鲜膜，静置30 min，使油茶饼粕与水混合均匀后装进组培瓶中，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2 试剂与仪器

无水乙醇、香草醛、浓硫酸、氯化钠等均为分析纯；真菌DNA试剂提取盒；CJ-1D洁净工作台；高速万能粉碎机；SPX智能型培养箱；电热鼓风干燥箱；自动高压灭菌锅；PHS-3C精密酸度计；V-5100型紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 茶皂素含量及其分析方法

茶皂素的提取方法采用微波辅助法[13]，测量方法采用香草醛-浓硫酸显色法[14]。

1.2.2 降解茶皂素菌种的筛选

初筛：取自然发酵的油茶粕，准确称取10 g样品用90 mL无菌水稀释并震荡20 min，梯度稀释涂布到分离培养基上，30 ℃培养3 d，根据单菌落大小、表面结构、质地、光泽和颜色等特征，挑选形态特征差异明显的单菌落进行划线纯化，编号并保存。

复筛：将实验所得菌株接种于PDA液体培养基中，30 ℃培养1 d后接种至油茶饼粕培养基中，30 ℃固态静置发酵,发酵72 h后测量茶皂素的含量，计算其降解率，并判断菌株降解茶皂素能力的强弱。

1.2.3 菌株的鉴定

1.2.3.1 菌株的形态学鉴定

按照《真菌鉴定手册》[15]和《中国真菌志》[16]的方法，将L-2菌株的孢子接种于PDA培养基平板上，30 ℃培养，分别于第 5天和第 10天观察菌落的颜色、质地、表面纹饰和生长速度等特征。

1.2.3.2 菌种的ITS鉴定

从 PDA培养基上轻轻刮取培养5 d左右的菌落边缘菌丝体5 mg，将其用液氮研磨成粉末状。采用真菌DNA提取试剂盒提取供试菌株DNA，引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′)扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果在GenBank 中进行 BLAST 相似性比对，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树。

1.2.4 培养条件优化的单因素实验

1.2.4.1 种子液的培养

将筛选出的菌种接种至PDA液体培养基中，培养温度为30 ℃、转速为180 r/min，恒温摇床培养18 h，作为发酵种子液备用。

1.2.4.2 固态发酵的初始条件

将油茶饼粕培养基进行灭菌处理后，接种10%的种子液，发酵温度为30 ℃，发酵时间为72 h。

1.2.4.3 发酵时间选择

在其他条件不变的情况下，设置发酵温度为30 ℃，初始含水量为80%，设置不同的发酵时间分别为12、24、36、48、72、96、120 h，之后检测茶皂素的降解率。期间每隔12 h摇瓶翻样1次，每个处理重复3次。

1.2.4.4 发酵温度选择

在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间，其他条件与处理同1.2.4.3，设置发酵温度为24、26、28、30、32、34、36 ℃。

1.2.4.5 初始含水量选择

在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间和发酵温度，其他条件与处理同1.2.4.3，设置初始含水量分别为为60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%。

1.2.4.6 初始加酸量选择

在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间、发酵温度和初始含水量，其他条件与处理同1.2.4.3，设置不同的初始加酸量分别为0.01 mol/L的HCl 2、4、6、8、10 mL。

1.2.5 黑曲霉降解油茶饼粕中茶皂素的条件响应面优化

在单因素实验基础上，采用Box-Bnhnken响应面法进行优化分析，设计温度、时间和初始加酸量3个因素，每个因素取3个水平，以(-1,0,1)编码，根据相应的实验后，运用Design Expert 软件对所得的数据进行二次回归拟合后得到二次回归方程，然后对各因素的主效应和交互效应进行分析，得到最优解，优化发酵条件并进行验证，最终确定利用黑曲霉降解茶皂素的最优的发酵条件。

2 结果与分析

2.1 样品的筛选结果

通过初筛得到6株目标菌种，经过复筛后得到目的菌株的降解率，目的菌种对油茶饼粕中的茶皂素的降解率如图1所示，各菌株的降解率有较大的差异。

图1 目的菌种对油茶饼粕中的茶皂素的降解率

本研究中的菌株来源于自然筛选，对于油茶饼粕中的茶皂素具有天然的降解优势，黑曲霉L-2在自然条件下的降解率达到了60%以上，对比其他的菌种来说，菌种具有一定的优势性；固态发酵相比于液态发酵在降解油茶饼粕中的茶皂素更具有优势，推测可能的原因是黑曲霉L-2是丝状真菌，在固态发酵中能够使油茶饼粕起到蓬松多孔的状态，增大了菌种接触营养和氧气的作用，液态发酵对于不溶于水的油茶饼粕的传质传氧有一定的限制作用。因此选取降解率最高的L-2作为后续实验的菌种。

2.2 苗种的形态学和分子鉴定

菌株L-2的平板培养正面形态图(左)和平板反面形态图(右)如图2所示。0 ℃恒温培养L-2,培养初期，培养基表面长出质地疏松的较干燥的白色菌落，外观形如丝状小绒毛，与培养基的结合比较紧密。5 d后，表面开始出现黑色孢子，均匀分布在菌落中间成熟部分。菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系统发育树如图3所示，菌株L-2的rDNA-ITS序列与黑曲霉AspergillusnigerHQ305563.1相似性达到了99%，结合形态学特征鉴定为黑曲霉Aspergillusniger。

图2 菌株L-2的平板培养正面形态图(左)和平板反面形态图(右)

图3 菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系统发育树

2.3 培养条件的优化

2.3.1 发酵时间对菌种降解茶皂素的影响

发酵时间对菌种降解茶皂素的影响如图4所示。发酵前期，随着时间的推移，降解率在逐步提高；96 h后，茶皂素的降解率趋于稳定，达到88.33%。在油茶饼粕发酵初期，由于黑曲霉可以产生一些活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶等，可以利用其产生的酶对油茶饼粕中大分子的营养物质进行降解，有助于黑曲霉L-2的生长。发酵中期由于营养物质的消耗，茶皂素作为营养物质提供菌体生长的需要，因此发酵中期茶皂素的降解率在不断的上升。发酵后期，油茶饼粕中的营养物质由于大量消耗，不足以为黑曲霉L-2的生长提供保障，茶皂素的降解率也趋于稳定的状态。

图4 发酵时间、发酵温度、初始含水量以及初始加酸量对于茶皂素降解率的影响

2.3.2 发酵温度对菌种降解茶皂素的影响

发酵温度对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着温度的升高，茶皂素的降解率一直在升高，在32 ℃时，茶皂素的降解率达到了最大值86.12%。温度高于32 ℃后，茶皂素的降解率下降的趋势很明显。温度对于菌株降解茶皂素的影响比较显著，因此选择最佳的降皂温度为32 ℃。

2.3.3 初始含水量对菌种降解茶皂素的影响

初始含水量对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着含水量的不断增加，茶皂素的降解率在不断的升高，在含水量在80%的时候达到最大88.15%。在含水量超过80%以后，茶皂素的降解率持续降低。固态发酵中，氧传递对于菌体的生长有至关重要的作用。含水量在80%以下，油茶饼粕培养基呈现一种疏松、多孔的状态，这对于氧气的传递有一定的促进作用；而随着含水量的升高，固体培养基越来呈现一种紧密的状态，影响氧的传递。含水量太低也会导致菌体生长缺水分而不能大量的生长，进而影响茶皂素的降解。因此选择80%的含水量作为最适含水量。

2.3.4 初始加酸量对菌种降解茶皂素的影响

初始加酸量对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着加酸量的不断增加，茶皂素的降解率在不断的升高，在加酸量在4 mL的时候达到最大89.31%。在加酸量超过4 mL以后，茶皂素的降解率持续降低。霉菌的最适生长环境为酸性条件，因此，添加一定的酸可以促进黑曲霉的生长，同时可以抑制其他有害微生物的生长，提高了茶皂素的降解率。初始加酸量超过4 mL以后，降解率随着酸的量的增加而降低，推测降解茶皂素的酶最适pH在加酸量4 mL附近，此时的pH=4.58。

2.3.5 响应面分析方案和实验结果

单因素实验分别从发酵时间、发酵温度、初始加酸量和含水量分析了不同的因素对于黑曲霉L-2降解油茶饼粕中的茶皂素的影响，为了更加准确简便地分析不同因素对降解茶皂素的交互影响，结合单因素实验的结果进行分析，选取对结果影响较大的3个因素发酵温度(A)发酵时间(B)初始加酸量(C)进行Box-Bnhnken实验设计，以茶皂素的降解率(Y)为响应值在全局范围内进行寻优，实验设计及结果，Box-Behnken实验因素与水平表见表1和Box-Behnken实验设计与结果见表2。

表1 Box-Behnken实验因素与水平表

表2 Box-Behnken实验设计与结果

回归模型方差分析见表3。应用Design-Expert 10.0.8软件对表2和表3中的结果进行二次回归分析，得到降解茶皂素的二次回归方程模型。由表3可知，从各个因素的显著性水平差异可知，对茶皂素的降解率的影响次序为B>A>C；二次项A2、B2、C2对茶皂素的降解率的影响都达到了极显著水平(P<0.001)。模型P<0.000 1，表明回归模型极显著，其校正决定系数AdjR2=98.46%表明仅有总变异的1.54%不能由该模型进行解释。相关系数R2=99.33%，表明该模型拟合程度较好，实验误差较小，失拟项不显著，回归方程可以较好地描绘各因素与响应值之间的真实关系。

表3 回归模型方差分析

注：**为极显著(P<0.01)，*为显著(P<0.05)，R2=99.33%,AdjR2=98.46%。

所得的二次多项回归拟合方程为：

茶皂素降解率=93.44-1.66A+2.678B+0.39C-1.69AB-0.63AC+1.32BC-6.45A2-5.07B2-3.09C2

根据方程得到的模型极值点取值为A=-0.177B=-0.313C=0.147，此时响应值Y的取值为最大值94.036%，即发酵温度31.293 ℃，发酵时间103.507 h，初始加酸量4.574 mL，为方便操作，发酵时间取31.3 ℃，发酵时间取103.5 h，初始加酸量为4.57 mL。

2.3.6 验证实验

利用正交实验所得到的数据进行培养基的配制，用响应面实验的结果作为发酵条件，重复3组实验进行茶皂素的降皂实验，实际测得降解率为93.96%，与预测值接近，说明回归模型真实可靠。

3 结论

单因素和响应面的分析结果表明：发酵温度、发酵时间、初始加酸量3个主要因素对黑曲霉L-2降解油茶饼粕中茶皂素有显著的影响，影响的大小为：发酵时间>发酵温度>初始加酸量。黑曲霉降解油茶饼粕中茶皂素的最佳条件为发酵时间取31.3 ℃，发酵时间取103.5 h，初始加酸量为4.57 mL，此条件下可使黑曲霉L-2对于油茶饼粕种的茶皂素有最佳的降解率，达到93.96%。