卿冬进，刘开强，邓国富，高利军，黄 娟，高 菊，伍 豪，戴高兴，梁海福，周维永*

(1. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007；2. 广西农业科学院， 广西 南宁 530007；3. 广西农业科学院水稻研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】水稻作为重要的粮食作物之一，是世界上约50 %人口的主食。水稻产量与品质性状存在负相关的关系，因此同时提高产量和品质是目前水稻育种研究者面临的一个重要的挑战性问题[1]。谷粒大小是影响稻米产量和品质的重要因素之一，因此对谷粒形状的改良是水稻育种的主要目标之一。在中国南方高温地区，谷粒越宽灌浆越难，从而造成米质下降。据报道，粒宽负调控基因GW8的功能缺失可使谷粒粒宽变窄，易灌浆，米质也随之提高[2]。因此，建立GW8基因的荧光分子标记并用于分子标记辅助选择育种对水稻米质改良有重要意义。【前人研究进展】目前为止，已有400多个与水稻粒型相关的数量性状位点(Quantitative Trait Loci, QTL)被定位，已有60个与水稻粒型相关的基因被克隆[3]，如GW2[4]、GW5/qSW5[5-7]、TGW6[8]、GL7/GW7/SLG7[9-11]、GW8[2]、GS3[12]、GL3.1/qGL3[13-15]、GS5[16-17]及GS6[18]等。这些粒型相关基因涉及复杂的基因调控网络，从调控细胞伸长或增殖开始，至籽粒灌浆过程结束为止[19-20]。部分已克隆的水稻粒型相关基因的分子标记已经被开发及应用，裔传灯等[21-22]通过分析GS3基因序列与GS5基因序列，分别开发了其功能标记，并利用所开发的2个分子标记分别鉴定了294份水稻微核心种质和2007-2013年江苏省审定的65份粳稻品种基因型。Wang等[2]发现水稻品种华粳籼74中重要粒型基因GW8在的启动子上有10 bp序列(GAGCTGAGCT)存在，其对该基因在幼穗中正常表达有重要调节作用，增加了谷粒粒宽；而GW8基因在Basmati 385中的启动子区缺失10 bp序列，引起基因下调表达，谷粒粒宽变窄，使稻米的外观品质提高。裔传灯等[23]根据GW8基因启动子10 bp的Indel及第3外显子A/C和T/G的变异位点分别开发功能标记，并对294份水稻微核心种质和65份粳稻品种进行了基因型鉴定，结果证明了这3个突变位点对稻谷粒型有重要的影响。【本研究切入点】PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system)技术，是基于扩增受阻突变的体系PCR(ARMS-PCR)技术[24]，并在此基础上增加两条不同荧光标记引物，通过不同的荧光信号检测基因的多态性。卿冬进等[25]利用该技术开发了水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记并验证其可靠性。本研究利用该技术开发GW8基因荧光分子标记，GW8基因的PCR扩增产物经过荧光扫描、软件分析直接获得基因分型结果，摆脱了琼脂糖和PAGE电泳分析的费时工作。【拟解决的关键问题】利用广西细粒优质杂交稻亲本材料美B与5个宽粒籼稻品种中GW8基因序列进行比对分析，发现美B的GW8第二内含子存在2个碱基缺失差异，因此开发其荧光分子标记，通过对42份籼稻亲本材料进行基因分型，并结合粒宽表型分析，证明该荧光分子标记的有效性。GW8基因荧光分子标记的建立为利用分子标记辅助选择技术跟踪该基因改良谷粒粒宽农艺性状提供了高效、可靠的基因分型技术。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻材料为广西农业科学院作物遗传改良生物技术重点开放实验室提供的42份籼稻亲本材料(表1)。

表2 GW8基因标记引物序列

1.2 谷粒宽的测量

在42份供试材料中分别选取具有代表性表型的谷粒10粒，并利用SC-G型自动种子考种及千粒重分析仪(万深检测科技公司，中国)进行粒宽测量。

1.3 水稻叶片DNA的提取

2018年5月25日，采取种植于广西农业科学院里建基地水稻田的42个籼稻亲本材料叶片，参考Murray等[26]的CTAB法提取水稻叶片的DNA。提取的DNA溶入1×TE缓冲液作为PCR扩增模板。

1.4 GW8基因的PCR扩增

参考卿冬进等[25]的方法对上述42份籼稻亲本材料的GW8基因进行PCR扩增，PCR反应体系为10 μl，其中包含：2×PARMS master mix 5 μl，10 mmol/L正向标记引物(Allele-AT) 0.15 μl，10 mmol/L正向标记引物(Allele-GC)0.15 μl，10 mmol/L通用反向标记引物(Common-R)0.15 μl，模板DNA(10～100 ng)1 μl， ddH2O 3.55 μl。PCR反应程序：95 ℃，5 min；95 ℃，20 s，65 ℃(-0.8 ℃/循环)，1 min，10个循环；95 ℃，20 s，57 ℃，1 min，32个循环。标记引物序列见表2。

1.5 基因分型鉴定

采用HEX、FAM和ROX三通道荧光扫描酶标仪(Tecan Infinite F200，瑞士)检测PCR扩增产物的荧光信号强度，然后将荧光信号值在网页(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)上用SNP decoder软件分析样品PCR扩增的FAM和HEX荧光信号值，并用散点图格式输出，对PCR扩增产物进行基因分型，如检测到FAM荧光信号的为2碱基缺失的GW8等位基因型，检测到HEX荧光信号的为不存在2碱基缺失的GW8等位基因型，同时检测到FAM和HEX的则为杂合基因型，荧光信号类型与基因型关系见表3。

表3GW8等位基因与荧光标记对应表

Table 3 Corresponding relation table ofGW8 alleles and fluorescence marker

基因名称Gene name荧光类型Fluorescence type等位基因型Genotype of allelesGW8FAM--ATHEXGCAT

1.6 统计分析

利用ClustalX软件对GW8基因序列进行等位分析；用Photoshop 7.0进行图像处理及制图；用JMP 11.0 软件的t检验对粒宽数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 GW8荧光分子标记引物设计

根据广西细粒优质籼稻保持系亲本材料美B中GW8基因序列与5个谷粒较宽的籼稻保持系亲本(美B、汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B)序列比对，其中美B中有2个碱基缺失(图1)，利用该InDel差异性为特异性引物的3’末端，设计共显性的分子标记PM-GW8。分子标记引物Allele-AT能与PARMS master mix中带FAM荧光的引物匹配，而Allele-GC可以与PARMS master mix中带HEX荧光的引物匹配，根据PCR扩增后获得不同的荧光信号而鉴定到不同的基因型。根据序列的SNP对比分析结果，预测PCR扩增后，美B中的GW8基因的扩增产物可以鉴定到FAM荧光信号，而其他5个籼稻保持系亲本材料的等位基因扩增后可以鉴定到HEX荧光信号，因此，谷粒较窄的美B中的GW8基因型可与其他谷粒较宽品种中的GW8基因型区分开。

图1 GW8基因中用于标记开发的序列等位分析结果Fig.1 Allelic analysis result of GW8 gene for maker development

图2 PM-GW8 对42份籼稻亲本的基因分型检测结果Fig.2 Genotyping result of 42 indica rice germplasms by using PM-GW8

2.2 分子标记PM-GW8检测GW8及等位基因在42份籼稻亲本中的分布

利用建立的荧光分子标记PM-GW8检测42份籼稻亲本材料的基因型，经PCR扩增、荧光扫描及其荧光信号分析软件处理后，分析结果显示仅在谷粒较窄的美B中检测到FAM荧光信号，而其他41份籼稻亲本材料中则检测到HEX荧光信号(图2)。根据该分子标记引物设计原理及其不同的荧光信号强度值进行分析，结果表明美B中存在的GW8谷粒较窄的等位基因型为纯合“--AT”，其他41份籼稻亲本材料中没有检测到FAM荧光信号，但检测到HEX荧光信号，其等位基因型为纯合“GCAT”。

图3 用于分子标记设计的6份籼稻亲本谷粒表型Fig.3 Grain phenotype of six indica rice germplasms for molecular marker design

2.3 籼稻亲本材料的粒型分析

对本研究中用于序列分析设计荧光分子标记的6个籼稻品种亲本材料进行粒宽测量，结果显示带有GW8“--AT”基因型的美B粒宽较窄，而带有GW8“GCAT”基因型的汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B粒宽较宽(图3)。t检验结果显示美B的粒宽与汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B相比，差异达显著水平(P<0.05，下同，表4)。对其他36份籼稻亲本材料进行粒宽测量，分析结果显示36份籼稻材料的粒宽都大于美B，其中有35份籼稻品种与美B之间存在显著差异(表4)。

表4 籼稻亲本材料的粒宽及PM-GW8分子标记检测结果

续表4 Continued table 4

编号Number品种名称Variety粒宽(mm)Grain widthGW8基因型Genotype of GW816金23B2.55±0.08∗GCAT17博B2.55±0.11∗GCAT18泰丰B2.39±0.13GCAT19岳4B2.60±0.09∗GCAT20岗46B3.42±0.09∗GCAT21华2048B3.50±0.14∗GCAT22恒丰B2.66±0.14∗GCAT23112B2.86±0.14∗GCAT24天丰B2.73±0.12∗GCAT25多系一号2.68±0.14∗GCAT26R7742.86±0.07∗GCAT27桂992.65±0.05∗GCAT28R2732.70±0.07∗GCAT29R7953.18±0.08∗GCAT30R75712.89±0.10∗GCAT31辐恢8383.48±0.14∗GCAT32R5273.02±0.11∗GCAT33R7892.56±0.05∗GCAT34华占2.57±0.08∗GCAT35138R2.52±0.88∗GCAT36测2532.79±0.12∗GCAT37桂红1号2.52±0.11∗GCAT38B3243.09±0.09∗GCAT39谷梅4号3.44±0.07∗GCAT40金围矮3.32±0.14∗GCAT41GW23.12±0.16∗GCAT42龙丰B2.64±0.06∗GCAT

注：“--AT”和“GCAT”分别代表GW8等位基因FAM荧光信号及HEX荧光信号；*表示经t检验，其他品种粒宽与美B差异达显著水平(P<0.05)。

Note: ‘--AT’ and ‘GCAT’ indicate FAM fluorescence and HEX fluorescence ofGW8 allele, respectively. * indicates significant difference between the grain width of meiB and that of other varieties byt-test(P<0.05).

3 讨 论

籽粒是水稻光合作用产物的重要贮存器官。水稻粒型与产量、品质有直接关系，特别是在我国南方地区，高温逼熟造成籽粒较宽品种的稻米垩白粒率较高，影响外观品质。一般细长粒稻米的垩白率较低，其外观品质也较好[27]。本研究根据广西优质杂交稻亲本保持系材料美B的籽粒粒宽较窄的特征，经测序发现该品种的GW8基因有2个碱基缺失，由此利用该InDel位点设计荧光分子标记，且通过DNA序列比对分析发现Wang等[2]已报道的GW8基因的该缺失位点在水稻品种Basmati中存在。虽然2个碱基缺失的InDel位点与裔传灯等[23]的研究中用于开发GW8功能标记的3个变异位点不同，但该变异位点也是与谷粒宽的表型性状连锁在一起，因此可用于开发其分子标记来跟踪GW8等位基因，改良谷粒宽的农艺性状。

分子生物学技术在水稻研究上的应用越来越广泛，与水稻产量、品质相关的粒型基因不断被克隆，但是这些功能基因在水稻育种应用上还很少，其主要受制于开发的分子标记成本高、等位变异类型多样化等。目前分子标记辅助选择技术已广泛应用于作物育种工作中，其优点是能够快速、精准跟踪目标基因，且不受环境因素的影响[28]。目前已报道的GW8基因分子标记尚少，裔传灯等[23]根据GW8的变异位点开发了分子标记，并对294份水稻微核心种质进行基因型鉴定，发现存在的8种单体型对水稻粒型性状有极其显著的影响。本研究主要利用PARMS技术开发了GW8基因的荧光分子标记PM-GW8，用于分子标记辅助育种，以区分宽粒和窄粒品种的GW8基因型。该分子标记能精确检测到籼稻亲本美B中存在2个碱基缺失的GW8等位基因，与普通的GW8分子标记相比，具有不需要进行DNA电泳的分析的简便性，通过荧光信号扫描和软件分析直接获得基因型，也可同时对大规模水稻品种的GW8基因进行高通量的基因分型。

水稻粒宽表型受GW8[2]、GW5[5-7]和WTG1[29]等多个基因的调控，GW8基因调控粒宽变化过程中，其他相关基因也会同时参与调控，影响粒宽的变化程度。本研究通过对42份籼稻亲本谷粒进行粒宽测量，发现泰丰B的粒宽与美B相比差异不显著，可能是由于泰丰B中存在的GW5及WTG1等相关基因对粒宽的调控作用造成了影响，导致GW8基因的调控效率降低。本研究利用PM-GW8荧光分子标记对籼稻亲本材料进行基因型检测，并结合谷粒粒宽测量试验，证明了该荧光分子标记的有效性，为利用GW8基因改良谷粒粒宽农艺性状提供了一种新的基因分型检测方法。但为了精准改良水稻粒型，提高水稻产量和品质，对利于粒型改良的相关基因资源还需进一步加强挖掘和利用，开发更多的分子标记，推动分子育种研究工作的发展。

4 结 论

运用PARMS方法结合水稻粒宽调控基因GW8的等位分析，开发了GW8基因荧光分子标记PM-GW8，并证明了该分子标记能够快速、有效地鉴定水稻中GW8的“--AT”和“GCAT”基因型，为利用分子标记跟踪GW8基因、改良水稻粒宽性状提供了基因分型新技术。