李豪，邹伟,2*，白光剑，徐静

1(四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡，643000) 2(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室(四川理工学院)，四川 自贡，643000)

农作物秸秆是目前自然界中最丰富的可再生资源，目前的利用方式主要包括还田、秸秆饲料、秸秆能源、秸秆工业原料和栽培食用菌[1]。农作物秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素以及木质素[2-3]，3种物质相互结合形成木质纤维素占秸秆干重的一半以上[4]。目前化学处理法如稀酸、浓酸处理等会带来成本问题、环境污染而难以推广，物理处理法多高耗能而不宜推广[5-6]。使用微生物处理秸秆具有绿色环保、成本低的优势，近年来受到越来越多的关注。

目前主要运用高产纤维素酶的菌株来处理农作物秸秆。纤维素酶是由多种复合酶系组成，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3种酶相互协同作用于纤维素，并将其降解[7-8]。纤维素酶主要来自细菌与丝状真菌，细菌由于产酶不多且多产在胞内故较少作为纤维素酶生产菌[9]，霉菌产生的菌丝能进入纤维素、半纤维素和木质素之中，分泌的纤维素酶能由内而外地降解纤维素，降解能力较强[10]。目前已发现有多种微生物菌属有纤维素降解功能，其中包括木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)等菌株[11-12]。关于产纤维素酶真菌的筛选目前也有很多，田云等[13]从蘑菇培养基质中获得1株高产纤维素酶的肉座菌株(Hypocrealessp.)真菌，李晓秀等[14]从土壤中筛选获得1株尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，曾思泉等[15]从红树林根际土壤中获得一株枝孢属菌(Cladosporiumsp.)等。目前工业用产纤维素酶菌株主要为真菌，并多集中在木霉属菌株[16]，其他高产纤维素酶真菌也具有很好的研究潜力。

本研究从树林腐殖质土壤中分离筛选出3株高产纤维素酶的菌株，以分离获得的3株菌株为研究对象，进行形态学鉴定和分子鉴定，为纤维素酶应用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

土壤取自自贡市附近树林腐烂树木和腐质土壤。

1.1.2 培养基

种子培养基[17]：羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，溶于去离子水1 000 mL。

分离培养基[18]：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，琼脂20 g，溶解至1 000 mL去离子水中。

液体产酶培养基[19](g)：CMC-Na 10，蛋白胨3.0，酵母膏0.2，(NH4)2SO42.0，KH2PO44.0，MgSO4·7H2O 0.3 g， 溶于1 000 mL去离子水中。

秸秆培养基：油菜秸秆粉10 g，蛋白胨3.0 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去离子水1 000 mL。

1.1.3 试剂及药品

柠檬酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH 4.8)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4等药品均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂。

1.1.4 仪器与设备

MJ-250恒温培养箱、TG-16医用离心机，四川蜀科仪器有限公司；phs-3C酸度计、YX280A型高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-1F净化工作台、HH-6D数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造；V-1000可见分光光度计，翱艺仪器有限公司；SKY-2102C恒温振荡器，上海苏坤实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离和初筛

取10 g土壤样品，溶解于已灭菌的100 mL蒸馏水中，放入摇床28 ℃、180 r/min振荡30 min进行富集培养。取出静置10 min后在超净工作台内取上清液1 mL梯度稀释到10-1～10-6，吸取10-4、10-5、10-6各0.2 mL涂布于分离培养基上，每个浓度设置2个重复。28 ℃恒温培养箱中培养3 d，选择生长旺盛的菌株转接到分离培养基上进行划线培养，直到得到纯培养进行初筛[18]。

将得到纯培养的菌株以三点法用牙签点种到分离培养基上，恒温培养箱28 ℃培养3 d，用1 mg/mL 刚果红溶液倒入平板染色30 min，蒸馏水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脱色30 min，测定菌落直径与透明圈直径，筛选出直径比大的菌株进行复筛[19]。

1.2.2 菌株复筛

将菌株接种于种子培养基培养36 h，按5%接种量接种于发酵培养基中28 ℃、180 r/min培养3 d，先将菌液纱布过滤再8 000 r/min离心10 min，取上清液进行酶活测定。

羟甲基纤维素酶(CMC酶)活测定：在25 mL比色管中加入1.5 mL质量浓度为10 mg/mL的CMC溶液，再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，在50 ℃ 下反应30 min，取出后加入1.5 mLDNS溶液，空白管加入0.5 mL 粗酶液迅速沸水浴10 min，冷却至室温后定容到25 mL，测定吸光值，计算酶活。

滤纸酶(FPA酶)活测定：将重50 mg的滤纸(长6 cm、宽1 cm)折成M形装入25 mL比色管中，加入1.5 mL pH为4.8的磷酸缓冲液，再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，50 ℃下反应60 min，取出后加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液迅速沸水浴10 min，冷却至室温后定容到25 mL，测定吸光值，计算酶活。酶活定义：在一定条件下，1 mL 粗酶液每分钟水解底物产生1 μg葡萄糖所需酶量定义为1个酶活单位(U)。

1.2.3 菌种鉴定

形态学鉴定：将菌株在CMC培养基上划线培养3 d后观察菌落形态特征，挑取少量菌体涂于载玻片在显微镜下观察菌株的形态特征。

分子鉴定：将菌株在种子培养基中液体培养36 h， 使用真菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。将提取得到的DNA作为模板，用真菌18S rDNA通用引物ITS1：(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS2：(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。

PCR反应体系为50 μL：I5Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，dH2O 22 μL。PCR反应条件：预变性温度94 ℃，5 min；变性：98 ℃，10 s；退火：53 ℃，15 s；延伸：72 ℃，10 s；循环数：35；总延伸：72 ℃， 5 min；4 ℃保持。

将PCR扩增产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，测序结果上传至NCBI进行序列同源性比对，选择同源性高的序列用MEGA 6.0软件构建菌株系统发育树，鉴定菌株种属。

1.2.4 菌株利用秸秆产酶及秸秆降解率

将菌株培养好的种子液接种到秸秆培养基中，在28 ℃、180r/min条件下摇床培养3 d，然后测定CMC、FPA酶活。同时在培养的第3天、第6天时测定秸秆降解率。测定方法为使用滤纸过滤发酵液，将滤渣在烘箱内80 ℃烘干至恒重，用失重法计算油菜秸秆失重率[20]。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌株的分离与初筛

将样品土壤稀释液涂布于以CMC-Na为唯一碳源的分离培养基培养，一共分离纯化出23株菌株，通过进一步点种于分离培养基，刚果红染色后测定透明圈直径与菌落比，筛选出8株透明圈菌落比值较大的菌株，其中菌株B03透明圈与菌落直径比最大达到2.53±0.23(图1)，详见表1。

图1 菌株B03刚果红染色的透明圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle by Congo red staining of strain B03

2.2 菌株酶活测定

将分离得到的透明圈与菌落直径比较大的菌株接种到种子培养基，180 r/min、28 ℃培养2 d后以5%的接种量接种到发酵培养基中，180 r/min、28 ℃条件下发酵3 d后取发酵液纱布过滤后于8 000 r/min条件下离心10 min得上清液测定酶活。结果显示，菌株B03的CMC酶活最高，达到(427.62±2.78)U/mL，FPA酶活也较高为(46.83±1.85)U/mL。菌株D11、E15 CMC酶活力也较高，将此3株菌作为后续研究对象。结果详见表1。

表1 菌株透明圈与菌落直径比和酶活Table 1 The diameter ratios of the transparent ring to the colony and enzyme activity

2.3 产纤维素酶菌株的鉴定

2.3.1 形态学鉴定

将菌株B03、D11和E15于CMC分离培养基上28 ℃条件下培养4 d后，观察菌株菌落形态。结果表明，3株菌的菌落形态相似，颜色均为灰绿色，菌落平铺状表面有绒毛状菌丝，为圆形或椭圆形。显微镜下3株菌株形态也相似，分身孢子梗端生或者侧生于菌丝，孢子梗直长少有弯曲，在其顶端产生孢子链，分身孢子为卵圆形(图2)。根据《中国真菌志》，菌株B03、D11和E15依据形态学特征初步鉴定为枝孢属(Cladosporiumsp.)。

图2 菌株形态特征Fig.2 Morphological characteristic of strain

2.3.2 分子鉴定

利用试剂盒提取获得的3株菌株基因组DNA，以提取得到的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行18S rDNA测序，将测序结果与NCBI上与已有微生物18S rDNA序列进行Blast分析，结果表明3株菌株与枝孢菌属有较高的同源性，达99%。选择与菌株同源性较高的菌株下载其18S rDNA基因序列，使用MEGA6.0构建系统发育树，最终鉴定筛选所得菌株B03、E15为枝孢菌(Cladosporiumsp.)，D11为极细枝孢菌(Cladosporiumtenuissimum)，如图3、图4所示。

图3 菌株电泳图Fig.3 The DNA and PCR fragments of strains

图4 菌株的18S rDNA系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strains based on the 18S rDNA sequence

2.4 菌株利用秸秆产酶及秸秆降解率

将菌株在以油菜秸秆为唯一碳源的液体培养基中培养3 d，然后滤纸过滤取滤液，8 000 r/min离心10 min得粗酶液，按照1.2.2中方法测定CMC、FPA酶活。在同样培养条件下分别培养了3、6 d的发酵过滤残渣，在80 ℃下烘干至恒重，以失重法计算油菜秸秆的降解率。由表2可知，3株菌株以油菜秸秆为底物发酵产酶能力比以CMC为底物时低，可能是由于油菜秸秆成分复杂，菌株不能完全利用其所有成分物质，导致产酶能力有一定降低，但酶活力依然保持较高。培养6 d后秸秆降解率均达到20%及以上，B03达26.80%，对油菜秸秆粉均有较好的降解效果。

表2 菌株酶活力和秸秆降解率Table 2 Enzyme activity and the degradation rate of straw of strains

3 讨论

土壤中富含大量微生物，包括细菌、真菌、放线菌等，腐殖土中含有较多木质纤维素，是自然富集产纤维素酶菌株的地方。目前关于产纤维素酶真菌的研究多集中于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)等，关于枝孢菌属(Cladosporiumsp.)产纤维素酶的报道较少[16]。枝孢菌在自然界中分布广泛，具有耐压、耐热等生理特性[21]，大多数已知的枝孢菌的模式菌为植物寄生或腐生菌，枝孢菌的生活方式决定了其具有分解木质纤维素的能力[22]。

本研究从腐质土壤样品中，利用刚果红染色初筛、酶活复筛筛选获得3株高产纤维素酶真菌，通过显微镜形态特征观察及分子生物学鉴定，该3株菌均属于枝孢菌属。3株菌中B03菌株以CMC为底物产酶CMC酶活达(427.62±2.78)U/mL，FPA酶活为(46.83±1.85)U/mL，其CMC酶活显著高于田云等[13]、陈丽燕等[23]报道的菌株。在以油菜秸秆为底物产酶时CMC酶活也有(352.50±4.17)U/mL，FPA酶活为(35.67±1.85)U/mL，以油菜秸秆粉为底物时产酶能力虽不如以CMC为底物时高，但其CMC酶活还是具有较高酶活，高于柴秀娟等[17]报道的酶活。在培养6 d后油菜秸秆降解率达26.8%，因测定时有菌体生长影响，故实际分解率应大于测定值。据报道，枝孢菌还有产木质素酶的能力[24]，后续还可研究其木质素酶能力。

综上本研究获得高产纤维素酶真菌是1株高产CMC酶的枝孢菌，所产CMC酶活力较高，同时也能以油菜秸秆为底物产酶，对油菜秸秆具有较好的分解率，是1株具有较高研究价值的菌株。