丁 娜，黄 月，田 龙

1)郑州人民医院神经内科 郑州 450003 2)河南省人民医院神经内科 郑州 450003

缺血诱发的脑组织功能损伤是临床上常见的病理过程，脑缺血能够诱发神经功能障碍，而神经细胞凋亡是神经功能障碍发生的重要原因之一[1]。miRNA是一种非编码的小RNA，在人体的多种组织中均有表达，不仅参与调控正常细胞的生理功能，还参与多种疾病的发生[2-3]。miRNA-210-3p在阿尔茨海默病、肿瘤、缺氧脑水肿等疾病中均有重要作用，还能够调控细胞凋亡等；大鼠脑组织缺氧缺血后miRNA-210-3p表达下调，miRNA-210-3p过表达可以减轻缺氧缺血诱发的脑组织水肿程度；过表达miRNA-210-3p具有抗神经细胞凋亡的作用[4-7]。本实验通过体外构建缺氧海马神经元HT22细胞损伤模型，探讨miRNA-210-3p对缺氧条件下海马神经细胞凋亡的影响及机制，为明确脑缺氧神经损伤发生机制及miRNA-210-3p在海马神经元损伤中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂海马神经元HT22细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司，以含有100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养液培养，同时在培养液中添加体积分数10%的胎牛血清，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗体购自美国BD公司；miRNA-210-3p模拟物和阴性对照模拟物购自美国Cellecta公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒和丙二醛(MDA)含量检测试剂盒均购自南京建成生物研究所；活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗体购自美国Abbkine公司；所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；cDNA合成试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2细胞转染和分组HT22细胞分成4组，分别为对照组、缺氧组、阴性对照+缺氧组、miRNA-210-3p+缺氧组。缺氧处理方法：HT22细胞用不含血清的细胞培养液培养，放在连续充入体积分数95% N2和体积分数5% CO2的培养箱中连续缺氧培养3 h。放在不充入缺氧气体的培养箱(37 ℃、体积分数5% CO2培养箱)中培养的细胞作为对照组。阴性对照+缺氧组、miRNA-210-3p+缺氧组分别转染阴性对照模拟物、miRNA-210-3p模拟物，并在转染后24 h进行缺氧培养3 h。阴性对照模拟物、miRNA-210-3p模拟物转染方法同Lipofectamine 2000说明书。实验重复3次。

1.3qRT-PCR检测海马神经细胞中miRNA-210-3p的表达各组细胞中添加1 mL的Trizol裂解溶液，按照常规方法提取总RNA；以10 μL的反转录体系合成cDNA，反转录条件：37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，4 ℃终止反应。miRNA-210-3p上游引物为5’-ATTATACAATAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，下游引物为5’-TAAAATATTACTGTGCGTGTGA CAGCGG-3’；内参U6上游引物为5’-CGTGCTTCG GCAGCACATAT-3’，下游引物为5’-TTTGCGTGT CATCCTTGCG-3’。PCR反应体系：5.0 μL 5×SYBR Green荧光染料，3.4 μL DEPC水，0.2 μL上、下游引物，1.0 μL cDNA样品，0.2 μL ROX。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miRNA-210-3p的相对表达量。实验重复3次。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡情况收集4组细胞，分别添加400 μL的Loading Buffer混匀后，依次添加各5 μL的PI和Annexin V-FITC溶液，混匀后置于避光条件下结合15 min。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.5Westernblot检测CleavedCaspase-3和CleavedCaspase-9蛋白表达水平4组细胞分别添加体积比100∶1的RIPA、PMSF裂解液，充分裂解后，吸取上清，添加至5×上样缓冲液中混匀煮沸5 min。分别配制100 g/L的电泳分离胶和50 g/L的电泳浓缩胶，在每个孔中加入40 μg的蛋白样品，调整电压(浓缩胶中的电压为80 V，分离胶中的电压为110 V)，观察溴酚蓝电泳至分离胶的底部以后方可停止电泳。取出凝胶，在300 mA电流条件下把凝胶上的蛋白转移到NC膜上，转膜操作置于冰上进行。称取5 g的脱脂奶粉加入到100 mL的TBST中配制成封闭液，把NC膜放在封闭液中孵育1 h后，再把NC膜放在Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9抗体反应液中孵育2 h，继续与二抗反应液结合反应2 h，添加ECL显色液，用Quantity One扫描曝光条带的灰度值，内参为GAPDH。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。实验重复3次。

1.6细胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量检测4组细胞按照1.2方法处理以后，分别用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-Px活性，用水溶性四唑盐法检测SOD活性，步骤均同试剂盒说明书，结果均以对照组细胞为参照。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学处理。4组细胞中miRNA-210-3p相对表达量、凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量、Cleaved Caspase-9蛋白相对表达量、SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞中miRNA-210-3p表达水平的比较结果见表1。从表1可以看出，miRNA-210-3p模拟物转染后的海马神经细胞经缺氧处理后，细胞中miRNA-210-3p表达水平升高。

表1 4组细胞中miRNA-210-3p相对表达量的比较

F=36.830，P<0.001；*：与缺氧组、阴性对照+缺氧组比较，P<0.05

2.2 4组细胞凋亡率和CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9蛋白表达水平的比较结果见图1和表2。可以看出，缺氧处理后的海马神经细胞凋亡率升高，细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平升高；miRNA-210-3p模拟物转染后的海马神经细胞经缺氧处理后，细胞凋亡率降低，细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平下降。

1：对照组；2：缺氧组；3：阴性对照+缺氧组；4：miRNA-210-3p+缺氧组

图1 4组细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表达

*：与对照组比较，P<0.05；#：与缺氧组、阴性对照+缺氧组比较，P<0.05

2.3 4组细胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的比较结果见表3。可以看出，缺氧处理后的海马神经细胞中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高；miRNA-210-3p模拟物转染后的海马神经细胞经缺氧处理后，细胞中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低。

表3 4组细胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比较(n=3)

*：与对照组比较，P<0.05；#：与缺氧组、阴性对照+缺氧组比较，P<0.05

3 讨论

缺血性脑疾病严重危害人类健康，缺氧缺血条件可以引起海马神经细胞凋亡，造成海马组织结构损伤，从而导致脑组织功能障碍[8]。本实验的结果表明，缺氧处理后的海马神经细胞凋亡率升高，说明成功构建了缺氧海马神经细胞体外损伤模型。

miRNA是一类由21～23个碱基组成的单链RNA，其不含有开放阅读框，不能编码蛋白质，参与细胞生长分化、血管形成、新陈代谢等过程[9-11]。目前发现miRNA-210-3p具有抑制电子传递链复合体表达、促进细胞迁移和血管新生等作用，在肿瘤等疾病中具有重要作用[12]。最近的研究[13]显示，缺氧缺血后的大鼠脑组织中miRNA-210-3p表达下降，miRNA-210-3p具有抑制缺血大鼠脑组织水肿的作用。另外，miRNA-210-3p具有抑制氧化应激条件下心肌细胞凋亡的作用，下调miRNA-210-3p具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用[14]。本实验的结果表明，缺氧处理后的海马神经细胞中miRNA-210-3p表达水平降低，而上调miRNA-210-3p表达可以降低缺氧诱导的海马神经细胞凋亡率，这说明miRNA-210-3p具有抗缺氧海马神经细胞凋亡的作用。

细胞凋亡在机体内环境稳态维持中具有重要作用，无论是病理性还是生理性的细胞凋亡都受到细胞内多种基因的严格调控作用。目前研究较为透彻的细胞凋亡机制与Caspase级联反应有关，Caspase蛋白家族在细胞凋亡过程中发挥不同的功效，Caspase-3和Caspase-9分别位于该凋亡反应的下游和上游，在细胞凋亡中发挥执行和起始因子的作用，二者只有被活化才具有诱导细胞凋亡的功能[15-16]。本实验的结果显示，上调miRNA-210-3p后的海马神经细胞经缺氧处理后，细胞中的Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平降低，提示上调miRNA-210-3p可能通过抑制Caspase来减少缺氧诱导的海马神经细胞凋亡。

众所周知，脑缺血损伤与组织氧化应激有关，而组织内氧化应激反应可以激活细胞中Caspase凋亡反应，从而诱导细胞凋亡[17]。MDA是细胞内脂质发生过氧化的产物，而细胞内抗氧化酶活性降低导致细胞内过量的氧自由基积累是脂质过氧化反应发生的重要原因，SOD、GSH-Px是广泛存在于细胞内的抗氧化酶，其活性的高低与细胞氧化应激水平有关[18-19]。本实验的结果表明，上调miRNA-210-3p可以提高缺氧条件下海马神经细胞中SOD、GSH-Px活性，同时降低细胞中MDA含量，说明上调miRNA-210-3p能够抑制缺氧诱导的海马神经细胞氧化损伤。

总之，上调miRNA-210-3p在缺氧诱导的海马神经损伤中发挥保护作用，其可能通过抑制细胞氧化应激、下调细胞Caspase凋亡反应发挥抗细胞凋亡的作用，这为研究缺氧海马神经细胞损伤提供了参考。