郝晓慧,赵明中，张玉芝，张祖峰，朱秋平，牛方卿

1)郑州市第九人民医院心脏中心 郑州 450053 2)阜外华中心血管病医院心内科 郑州 450000

动脉粥样硬化是一种严重的心血管系统疾病，其与2型糖尿病、冠心病等的发生关系密切。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OxLDL)是一种促动脉粥样硬化发生因子，在动脉粥样硬化发生时表达升高，具有损伤血管内皮细胞的作用[1-2]。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)是一种细胞转录调控因子，具有抑制细胞增殖和生长的作用，其在分化细胞中表达水平较高，而在去分化的胚胎干细胞、胚胎瘤细胞等细胞中低表达[3]。有研究[4-6]显示，CREG参与动脉粥样硬化的发生，在动脉粥样硬化患者、动物模型动脉粥样硬化组织中均表达下调；CREG还可以减轻ApoE-小鼠动脉粥样硬化程度和抑制VP-16诱导的血管内皮细胞凋亡。CREG在OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤中的作用目前尚不明确。本实验观察了过表达CREG对OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响，为研究动脉粥样硬化血管损伤的发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料血管内皮细胞购自北京北纳创联生物技术研究院。pLNCX-CREG重组逆转录病毒和对照逆转录病毒由湖南丰晖生物科技有限公司构建。OxLDL购自北京索莱宝科技有限公司，蛋白裂解液购自碧云天生物技术研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，CREG抗体购自美国Santa Cruz公司，Trizol法RNA提取试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，反转录试剂盒购自德国Qiagen公司，Real-time PCR试剂盒购自上海索宝生物科技有限公司，活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平检测试剂盒购自上海研拓生物科技有限公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒购自北京吉美生物技术有限公司，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司，活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗体购自美国CTS公司。

1.2细胞分组取血管内皮细胞接种到24孔板，接种密度为1×106个/L。分为4组，空白对照组不处理；OxLDL组用含100 mg/L OxLDL的细胞培养液培养24 h；另2组分别感染对照逆转录病毒(阴性对照组)和pLNCX-CREG重组逆转录病毒(pLNCX-CREG组)，用800 mg/L的G418筛选稳定转染的血管内皮细胞，之后均用含100 mg/L OxLDL的细胞培养液培养24 h。

1.3细胞中CREGmRNA表达的检测采用Real-time PCR。利用Trizol法RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，-80 ℃保存。反转录合成cDNA，步骤参照反转录试剂盒说明书。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：CREG上游5’-TACTGAGTCCGCTGCAACAAG-3’，下游5’-ATGAGCCTTGGAAGACCTGTCG-3’；β-actin上游5’-AAGGATTCCTATGTGGGC-3’，下游5’-CATCTCAAGCTCGAAGTC-3’。反应体系：2 μL的cDNA，上、下游引物各0.4 μL，10 μL的SYBR Advantage Premix，0.4 μL的ROX Dye，6.8 μL ddH2O。反应程序：94 ℃反应5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 min，40个循环。依照2-ΔΔCt方法计算CREG表达水平。实验重复3次，下同。

1.4细胞中CREG蛋白表达的检测采用Western blot法。取上述各组细胞，添加PMSF/RIPA蛋白裂解液，吹打混合裂解，4 ℃高速离心。吸取上清，用常规BCA法定量检测，保存于-80 ℃。蛋白样品上样量20 μg，电泳后常规方法湿转膜，将转膜后的NC膜置于封闭液(10 mL的TBST溶解300 mg脱脂奶粉)中37 ℃反应1.5 h。加入用封闭液按1∶4 000稀释的CREG一抗，4 ℃条件下过夜反应。加入同法配制按1∶4 000稀释的HRP标记的二抗，室温结合1.5 h，ECL显色试剂盒显色，采集图像并分析CREG和内参β-actin条带的灰度值，二者的比值即为CREG蛋白的表达水平。

1.5细胞培养液中MDA含量、SOD活性及ROS水平检测取4组细胞，检测细胞培养液中MDA含量和SOD活性，同时检测ROS水平，步骤均参照试剂盒说明书。MDA检测用硫代巴比妥酸法，SOD检测用黄嘌呤氧化酶法，ROS检测用DCFH-DA法。

1.6细胞凋亡检测采用流式细胞术。取4组细胞，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化，每组收集1×106个细胞，用PBS洗涤3次，添加500 μL的Binding Buffer后，再依次添加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，混合后孵育15 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7细胞中CleavedCaspase-3蛋白表达水平的检测取4组细胞，用Western blot法检测Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平，Cleaved Caspase-3抗体按1∶600稀释，余步骤同1.4。

1.8统计学处理用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较4组间以上指标的差异，两两比较用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞中CREG表达的比较见图1、表1。与空白对照组比较，OxLDL组和阴性对照组细胞中CREG mRNA和蛋白的表达水平均降低，而pLNCX-CREG组CREG mRNA和蛋白表达水平均较OxLDL组和阴性对照组升高。

1～4:分别为空白对照组、OxLDL组、阴性对照组、pLNCX-CREG组

图1 4组细胞中CREG蛋白的表达

*:与空白对照组比较，P<0.05；#:与OxLDL组及阴性对照组比较，P<0.05

2.2 4组细胞培养液中氧化损伤因子水平比较见表2。与空白对照组比较，OxLDL组和阴性对照组SOD活性降低，MDA和ROS水平升高；与OxLDL组及阴性对照组比较，pLNCX-CREG组细胞中SOD活性升高，MDA和ROS水平降低。

表2 4组细胞培养液中氧化损伤因子水平比较(n=3)

*:与空白对照组比较，P<0.05；#:与OxLDL组及阴性对照组比较，P<0.05

2.3 4组细胞凋亡率及CleavedCaspase-3蛋白表达水平比较见图2、表3。与空白对照组比较，OxLDL组和阴性对照组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高；与OxLDL组及阴性对照组比较，pLNCX-CREG组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低。

1～4：分别为空白对照组、OxLDL组、阴性对照组及pLNCX-CREG组

图2 4组细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较

*:与空白对照组比较，P<0.05；#:与OxLDL组及阴性对照组比较，P<0.05

3 讨论

动脉粥样硬化是多数心脑血管疾病发生的基础，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的机制之一。动脉粥样硬化发生时，OxLDL等刺激血管内皮细胞致细胞发生过度凋亡和氧化损伤，完整的血管组织受到破坏，最终影响血管正常功能发挥[7-9]。动脉粥样硬化的危险因素主要有高血压、糖尿病、肥胖、OxLDL等，其中OxLDL是动脉粥样硬化发生的必要条件[10-13]。本实验结果表明，OxLDL处理后血管内皮细胞凋亡率升高，细胞中ROS水平也升高，说明OxLDL能够诱导血管内皮细胞损伤，提示成功构建了动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤模型。

CREG蛋白含有220个氨基酸，具有3个磷酸化位点，可以通过与不同的配体结合发挥多种生物学功能[14]。研究[15-16]表明，CREG一方面能够与腺病毒的E1A结合，从而激活下游靶基因，促进细胞增殖；另一方面还能够与E1A竞争性结合靶基因，从而抑制E1A对靶基因的激活，发挥抑制细胞增殖的作用；CREG同样可以结合哺乳动物体内的E2F或竞争性地结合靶基因从而发挥增殖促进或抑制作用。近年来的研究[17-18]表明，CREG在动脉粥样硬化血管中表达下调，并且能够降低血管内皮细胞凋亡水平，此外，CREG还具有减轻小鼠动脉粥样硬化的作用。以上研究均表明，CREG可能在动脉粥样硬化血管损伤中发挥保护作用。本实验结果显示，OxLDL处理后的血管内皮细胞CREG表达下调，而感染CREG重组病毒后过表达CREG能够减轻OxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡，这提示过表达CREG能够抑制OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤。氧化应激是动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤的重要机制之一，OxLDL能够刺激血管内皮细胞中抗氧化酶SOD活性下调，导致细胞内ROS不能被及时清除。ROS可以激活细胞中Caspase凋亡反应，从而诱导细胞凋亡发生；另外，ROS还能够引起细胞中脂质过氧化反应，产生大量的MDA。因此，细胞中MDA含量、SOD活性及ROS水平可以间接反映细胞氧化损伤程度[19-21]。研究[22]显示，CREG具有抗氧化应激的作用，其可以减少盐敏感大鼠冠状动脉中MDA含量。本实验结果表明，CREG过表达可以减少OxLDL诱导的血管内皮细胞中ROS和MDA含量，提高SOD活性，减少细胞中活化的Caspase-3蛋白表达，提示过表达CREG具有抗OxLDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤的作用。

总之，CREG可降低OxLDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤并抑制细胞凋亡，但目前对CREG靶向调控动脉粥样硬化血管内皮细胞氧化损伤和凋亡的机制尚不明确；本实验结果为研究动脉粥样硬化血管损伤提供了参考，为明确CREG在心血管系统疾病中的作用奠定了基础。