何悦洋，李江峰，聂亚莉，张 弛，马亚楠，顾思梦，洪春丽，杨卫红，张莉蓉

1) 郑州大学基础医学院临床医学系 郑州 450001 2) 郑州大学基础医学院机能实验中心 郑州 450001 3) 郑州大学基础医学院药理学系 郑州 450001 4) 郑州大学基础医学院法医学系 郑州 450001

CYP3A是一种重要的CYP450酶系，在人肝组织内含量丰富，主要包括CYP3A4和CYP3A5，可代谢许多临床药物。已知编码CYP3A基因的遗传变异是引起临床上CYP3A代谢药物在不同个体间药效差异和药物安全性的重要因素[1-2]。体内外研究[3-9]表明，CYP3A4基因的遗传变异CYP3A4*22、CYP3A4*1G(rs2242480)可通过影响CYP3A4的表达与活性从而影响药物的疗效。rs4646440位于rs2242480下游，两者均位于CYP3A4内含子10中[10]。有文献[11]报道rs4646440与患者美沙酮维持治疗的严重副作用和戒断症状有关。已知rs2242480与CYP3A5 rs776746(CYP3A5*3)存在较强的连锁不平衡关系。本研究的主要目的是探讨rs4646440与rs2242480、rs776746之间的连锁关系及其与CYP3A4表达和活性的关系，以期阐明不同个体间CYP3A4活性差异的机制，为临床个体化用药提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料54例成人正常肝组织标本来源于郑州大学第一附属医院肝胆外科手术患者，均为病灶周围的正常肝组织，研究方案得到该院伦理委员会的批准，患者已签署知情同意书。主要试剂与仪器：基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司)，PCR试剂盒(TaKaRa公司)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 荧光定量试剂盒(大连宝生物技术有限公司)，引物合成由Life Technologies(上海)贸易有限公司完成，PCR扩增仪(德国Biometrd公司)，水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析系统(美国Syngene公司)，高效液相色谱(HPLC)仪(美国Waters公司)，7500 Fast实时荧光定量 PCR 系统(美国ABI公司)，咪达唑仑和1-OH咪达唑仑(北京汇智泰康医药科技公司)。

1.2基因分型用DNA提取试剂盒从肝组织标本中提取DNA。PCR所用引物由作者设计或来自参考文献[10,12],引物序列及相关信息见表1。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，补充ddH2O至25 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步验证后送Life Technologies(上海)贸易有限公司测序，并将测序结果与NCBI预期序列进行比对。

表1rs4646440、rs2242480、rs776746PCR引物

引物序列 (5’-3’)产物大小/bprs4646440上游:GTCCCCTTAGCTGTATCCAC下游:CCTGGTTCCTAGCTTGGCTT433rs2242480上游:CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT下游:AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC287rs776746上游:CATGACTTAGTAGACAGATGAC下游:GGTCCAAACAGGGAAGAAATA293

1.3CYP3A4mRNA表达的测定提取22例肝组织中的总 RNA后反转录成 cDNA。CYP3A4及内参基因GAPDH引物均来自文献[11,13]，见表2。Real-time PCR 反应体系：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板cDNA 2 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 个循环。采用 SYBR 染料法在实时荧光定量 PCR 仪上检测 mRNA 的表达，以2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达水平。

表2CYP3A4及GAPDHPCR引物

引物序列 (5’-3’)产物大小/bpCYP3A4上游:GCAGGAAAGCTCCATGCACATAG下游:GAGAAGCCAGGTTTCCATGG132GAPDH上游:GTCAGTGGTGGACCTGACCT下游:TGAGCTTGACAAAGTGGTCG212

1.4HPLC法测定CYP3A4的活性取22例肝组织样本，参照文献[14]，用差速离心法制备肝微粒体，BCA法测定微粒体蛋白含量。以咪达唑仑作为底物，用HPLC法检测肝微粒体酶活性，CYP3A4活性用1-OH咪达唑仑生成速度(V)表示。用回归分析及Eadie-Hofstee 求出CYP3A4活性的参数Vmax。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0处理数据。用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用Haploview软件进行位点连锁分析，连锁不平衡的程度用D＇ 和r2表示。用两独立样本t检验比较rs4646440 CC组与CT+TT组CYP3A4 mRNA表达水平及CYP3A4活性的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1基因多态性分析rs4646440、rs2242480和rs776746位点的基因型频率分布见表3。3个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明群体基因遗传平衡。等位基因rs4646440 T、rs2242480 A、rs776746 G的频率分别为16.7%、18.5%和 70.4%。测序结果见图1。

表3不同位点基因型频率的分布

位点及基因型病例数(%)χ2Prs4646440 CC37(68.5) CT16(29.6)0.2400.624 TT1(1.9)rs2242480 GG36(66.7) GA16(29.6)0.0180.894 AA2(3.7)rs776746 AA6(11.1) AG20(37.0)0.6750.411 GG28(51.9)

上：rs4646440；中：rs2242480；下：rs776746图1 3种基因分型结果

2.2不同位点之间的连锁关系分析结果(图2)显示3者之间具有强连锁不平衡关系，rs4646440与rs2242480的连锁关系比与rs776746的连锁关系强，而rs4646440与 rs776746的连锁关系比rs2242480与rs776746的连锁关系弱。

2.3不同rs4646440基因型组间CYP3A4mRNA表达水平及CYP3A4活性的比较CC 组与CT+TT组CYP3A4 mRNA表达水平及CYP3A4活性相比，差异无统计学意义。见表4。

左：r2值；右：D′值

组别nCYP3A4 mRNAVmax/[μmol·(min·g)-1]CC组111.45±1.060.33±0.11CT+TT组111.21±0.960.35±0.14t0.1131.504P0.5980.703

3 讨论

CYP3A4是人肝脏中最重要的药物代谢酶，能代谢他汀类降血脂药、环孢素等抗移植排斥药物、抗肿瘤药物、麻醉药物等50%以上常用的临床处方药物，然而这些药物的疗效与副作用在不同个体间存在着明显的差异。到目前为止，不同个体间CYP3A4表达差异的机制尚不完全清楚。近年来内含子基因多态性调控基因愈来愈受到重视[15-16]。

本研究分析了CYP3A4 rs4646440与rs2242480、CYP3A5 rs776746之间的连锁关系以及其与CYP3A4表达和活性的关系，结果表明rs4646440与rs2242480位点一样，具有较高的等位基因频率：rs4646440 T等位基因频率为16.7%；并且发现3个位点之间具有强连锁不平衡关系，其中rs4646440与rs2242480的连锁关系强于与rs776746的连锁关系，这可能与前两个SNP在同一基因(CYP3A4)、同一内含子中，而后者位于CYP3A5 基因有关；rs4646440与rs2242480的连锁关系支持了Wang等[17]的观点。然而，rs4646440与rs776746的连锁关系弱于rs2242480与rs776746，说明前两者连锁在CYP3A表达中起的作用可能小于后两者。

本课题组首次在肝组织水平研究了rs4646440基因多态性与CYP3A4 mRNA表达及活性的关系，发现该SNP与CYP3A4 mRNA表达及活性不相关，说明rs4646440可能与药物的疗效及副作用无关，此结论支持了rs4646440多态性不影响中国癫痫患者用卡马西平单药治疗时卡马西平代谢的结论[17]。

总之，本研究结果表明CYP3A4 rs4646440、rs2242480和CYP3A5 rs776746之间存在较强的连锁不平衡关系，同时还发现rs4646440基因多态性与CYP3A4 mRNA表达水平及活性无关。此结果丰富了CYP3A4基因内含子SNP与酶活性关系之间的研究内容，为将来其他CYP3A4内含子SNP的研究提供了理论基础。