田志龙，潘林香，王金文，马 琳，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.莱芜市嬴泰有机农业科技发展有限公司，山东 莱芜 271114；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南 250100）

绵羊的产羔数直接受排卵数影响，而在卵泡发育过程存在多方面因素影响排卵数。近年来的研究发现，TGF-β/SMADs信号通路在哺乳动物的卵巢卵泡的发育、卵泡的选择与闭锁过程中发挥着极其重要的调控作用［1］。在这一过程中，该通路中的关键成员（配体、受体、信号分子等）在整个生殖系统中都有协调的时空表达模式、控制和调节卵巢的生理学功能［2］。SMAD1作为TGF-β/SMADs信号通路下游重要的转录因子，广泛分布于不同的组织并介导多种类型的生理过程［3］。雌激素是一类具有广泛生物学效应的类固醇激素，主要由卵巢和胎盘分泌产生。雌激素与ESR结合可引发基因组效应或非基因组效应，从而影响细胞的功能［4］。研究表明，ESR2通过直接对卵巢作用和在下丘脑-垂体-卵巢轴的负反馈两条途径调节卵泡的发育和排卵［5］；ESR2敲除的小鼠卵巢有腔卵泡和黄体数量降低且趋向闭锁和凋亡，导致卵泡成熟和排卵受限制，最终降低动物繁殖能力［6］。

鲁中肉羊是近期在山东地区培育的绵羊新类群，具有饲料报酬高、耐粗饲、抗病、适合舍饲圈养等特点［7］。本试验以此为研究对象，利用本实验团队前期重测序结果结合Sequenom MassARRAY®SNP技术进行SNP分型检测，并使用SPSS软件分析产羔数和多态性之间的关系，以期为绵羊分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

384只鲁中肉羊血液样品采自莱芜市嬴泰有机农业科技发展有限公司，同时记录鲁中肉羊产羔数、胎次和产羔季节等信息。颈静脉采血，柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存备用。

1.2 DNA提取

试验绵羊血液样本DNA提取使用天根血液DNA试剂盒，并使用Nano Drop 2000检测DNA样本浓度，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测。

1.3 基因分型

对SMAD1基因g.12485895A＞G位点和ESR2基因g.73324006C＞T位点在鲁中肉羊中进行基因分型，采用Sequenom MassARRAY®SNP 技术［8-9］进行基因型检测。分型样品为DNA，每个样品需要量20 μL，DNA浓度40～80 ng/μL。

1.4 数据处理

使用 Microsoft Excel 2013统计g.12485895A＞G位点的基因频率、基因型频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），随后进行哈代温伯格检验。产羔数关联分析参考田志龙等［10］的方法。用SPSS19.0软件程序中一般线性模型完成鲁中肉羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 DNA检测

提取鲁中肉羊血液总DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带清晰，无降解（图1）。Nanodrop 2000检测DNA的A260/A280为1.8～2.0，表明提取的DNA的纯度较高，可用于后续试验。

图1 DNA检测

2.2 群体遗传学分析

通过基因分型发现，SMAD1基因g.12485895A＞G位点共有3种基因型，分别是AA、AG和GG（图2）。其中，GG基因型为优势基因型，G为优势等位基因。ESR2基因g.73324006C＞T位点存在CC和CT两种基因型，其中CC型为优势基因型，C为优势等位基因。从表1可知，SMAD1基因g.12485895A＞G位点在鲁中肉羊群体中表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），卡方适合性检验结果表明，该位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05）。ESR2基因 g.73324006C＞T位点在鲁中肉羊群体中表现为低度多态（PIC＜0.25），卡方适合性检验结果表明，该位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

2.3 产羔数关联分析

由表2可知，SMAD1基因g.12485895A＞G位点不同基因型与鲁中肉羊产羔数之间无显著关联（P＞0.05）。ESR2基因g.73324006C＞T位点中CC型母羊产羔数显著高于 CT型（P＜0.05）。

图2 SMAD1和ESR2基因分型结果

表1 SMAD1和ESR2基因多态位点的群体遗传学分析

表2 SMAD1和ESR2基因不同位点与鲁中肉羊产羔数的关系

3 讨论

3.1 SMAD1基因多态性与动物繁殖性能的关系

现阶段关于SMAD1基因多态性与动物繁殖的报道多集中于水生动物，在哺乳动物中的研究较少。池秋蝶等［11］通过外显子测序获得文蛤Smad1基因多态信息，并发现其多态性可以影响文蛤的生长发育。对g.12485895A＞G位点进行基因定位研究发现，该位点处于SMAD1基因第2内含子区域。关于内含子变异影响动物表型的报道很多。

在 扬 州 鹅 的 研 究 中 发 现［12］，KIAA1462 基 因 的rs1714766362突变和启动子区域的c.-413C＞G突变紧密连锁，可以通过调节糖皮质激素受体的结合亲和力，影响鹅的产蛋性。皖江白鹅SMAD9基因内含子2的C＞T变异，显著影响其产蛋性能［13］。秦川牛SMAD3基因内含子 3（g.101664C＞G）和内含子 5（g.114523A＞G）变异显著影响其体重、胸围和臀部长度［14］（P＜0.05）。这些研究表明，内含子变异不仅影响转录和剪接过程，还可以通过控制基因表达来调控动物表型。Xu等［15］研究发现，位于SMAD1基因内含子区域的rs40635766突变与湖羊繁殖力密切相关。本研究发现，SMAD1基因g.12485895A＞G位点在鲁中肉羊处于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），卡方检验显示，该位点在鲁中肉羊群体属于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05）。这和该群体仍处于持续选育阶段有关，人工选择使得该位点处于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05）。关联分析显示，g.12485895A＞G位点与鲁中肉羊产羔数没有显著关联（P＞0.05）。

3.2 ESR2基因多态性与动物繁殖性能的关系

国内外许多研究证实，ESR基因是调控猪高产仔数的主效基因之一［16］。Hewitt等［17］在小鼠中的研究结果表明，敲除ESR基因后将导致小鼠LH激素调节紊乱、卵巢不排卵等现象。对小尾寒羊［18］和湖羊［19］的研究表明，ESR基因与绵羊多羔繁殖性状紧密相关。郭海燕等［20］利用PCR单链构象多态性技术及基因测序技术对湖羊ESR基因多态性进行了检测，并与湖羊产羔数进行了关联分析。结果在ESR基因第1外显子363位发现C＞G突变，但是该突变不能显著影响湖羊产羔数。本研究发现，ESR2基因g.73324006C＞T位点在鲁中肉羊处于低度多态（PIC＜0.25），卡方检验显示，该位点在鲁中肉羊群体属于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）；关联分析显示，g.73324006C＞T位点多态性与鲁中肉羊平均产羔数显著相关（P＜0.05），且CC型母羊产羔数显著高于CT型母羊，说明该突变在一定程度上改变了产羔数，基因定位发现g.73324006C＞T位点在ESR2基因第8外显子上，并导致精氨酸突变为组氨酸。猜测是由于该位点突变导致蛋白发生变化，影响ERβ发挥生理功能，最终导致绵羊产羔数发生变化。

4 结论

SMAD1基因g.12485895A＞G位点与鲁中肉羊产羔性状无关，ESR2基因g.73324006C＞T位点对鲁中肉羊产羔数性状的选育具有一定的指导意义。