向荣 曲利娟 徐宝卿

【摘要】目的：探讨PASM-Masson和IV型胶原染色在内翻性与浸润性膀胱尿路上皮癌鉴别诊断中的意义。方法：收集诊断为内翻性生长和浸润性生长的膀胱尿路上皮癌HE切片病例共100例，分别对其进行PASM-Masson染色和IV型胶原染色。结果：PASM-Masson染色和IV型胶原染色均能清晰地显示出尿路上皮基底膜完整或者缺损情况。PASM-Masson染色：浸润性生长尿路上皮癌中基底膜染色完整4例，缺损46例;内翻性生长尿路上皮癌中基底膜染色完整42例，缺损8例，两者差异有统计学意义（p<0.01）。IV型胶原染色：浸润性生长尿路上皮癌中基底膜染色完整3例，缺损47例;内翻性生长尿路上皮癌中基底膜染色完整40例，缺损10例，两者差异有统计学意义（p<0.01）。结论：PASM-Masson和IV型胶原染色可用来鉴别诊断膀胱尿路上皮癌内翻性生长和浸润性生长，对膀胱尿路上皮癌有无浸润的诊断具有重要意义。

【关键词】 膀胱尿路上皮癌;PASM-Masson;IV型胶原;内翻;浸润

【中图分类号】R181.3+【文献标识码】B【文章编号】2095-6851（2019）02-034-01

膀胱癌是发生在膀胱黏膜上皮的恶性肿瘤，其发病率在泌尿系统肿瘤排第一位[1]。膀胱癌中最常见的是尿路上皮癌，非浸润性膀胱尿路上皮癌和浸润性膀胱尿路上皮癌的侵袭性和恶性程度不一样，区分两者对于患者的治疗和预后具有重要意义。内翻性尿路上皮癌具有内生的生长方式[2]，但肿瘤组织未突破基底膜生长。在无法明确诊断的情况下，单纯依靠普通HE切片，会出现误诊。尤其是内翻性生长的癌有时候细胞形态紊乱，炎症反应较重，结构异型，很难判断是否发生浸润。由于内翻性生长的非浸润性尿路上皮癌常具有完整的基底膜，通过判断基底膜的完整性可鉴别有无发生浸润。常规HE切片基底膜着色较差，有时难以明确诊断。因此本研究采用特殊染色和免疫组化染色来显示膀胱癌基底膜的表达情况，进而判断膀胱尿路上皮癌内翻性生长和浸润性生长。选取南京军区福州总医院2012年1月-2018年8月膀胱尿路上皮癌100例，分别对其进行PASM-Masson染色和IV型胶原染色，探讨其病理学特征。

1资料和方法

1.1材料

1.1.1收集2012年1月至2018年8月在南京军区福州总医院病理切片及蜡块100例，其中病理诊断为内翻性生长尿路上皮癌50例，浸润性生长尿路上皮癌50例，年龄为22-70岁，中位年龄46岁。

1.1.2主要试剂与仪器 10%福尔马林;IV型胶原鼠抗人单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）;六氨银水溶液（实验室自配）;组织包埋机（LEICA公司）;轮转切片机（LEICA 公司）;电热恒温干燥箱（上海一恒科技有限公司）;显微镜（OLYMPUS 公司）;显微镜数码照相系统（OLYMPUS 公司）

1.2染色方法

1.2.1制片 取膀胱尿路上皮标本组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋，3μm厚连续切片，常规脱蜡脱水。

1.2.2免疫组化染色法 按照石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色主要步骤：组织切片二甲苯脱蜡5分钟X 3次，100%、95%和75%乙醇脱水各5分钟，自来水流洗5分钟;高温高压抗原修复;蛋白酶消化液当日配置并37℃预热，切片消化后用PBS洗3次，每次2min;切片浸入3%过氧化氢水溶液10分钟，阻断内源性过氧化物酶;PBS洗3次，每次2分钟;加第一抗体，室温下孵育20min，PBS洗3次，每次2min;滴加酶标抗鼠聚合物，室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次2min;滴加新鲜配置的AEC显色液;镜下控制显色1-3分钟，水洗2分钟，改良Carazzi苏木素液复染，流水洗5分钟;湿片组织上滴加水性封片剂，烤干后再用中性樹胶加盖玻片二次封片。

1.2.3PASM-Masson染色法 切片浸入新鲜配置的3%过碘酸水溶液20分钟，水洗3分钟，蒸馏水洗3次;浸入六胺银工作液，水浴58℃-60℃中染色50-60分钟，每0.5小时换液一次，显微镜下控制，直到基底膜呈黑色为止，蒸馏水洗3次;用0.2%氯化金水溶液调色约2分钟，蒸馏水洗2次;浸入0.25%硫代硫酸钠水溶液中2-3分钟，水洗3分钟;改良Carazzis苏木素液染色20-30分钟，水洗;1%盐酸水溶液中过一下，Masson液中染色5-7分钟，水洗;在0.1%固绿水溶液中染色2-3秒，急入水洗;梯度乙醇脱水，吹干，中性树胶封片。

1.2.4结果判读 IV型胶原表现为连续完整的棕黄色线性结构标为（+），表现为连续性中断、染色浅淡或缺失标为（-）。PASM-Masson染色细胞核呈红色，免疫复合物呈红色，基底膜呈黑色、胶原纤维呈黄绿色;基底膜染色连续完整标为（+），基底膜染色连续性中断标为（-）。

1.3统计分析使用SPSS 22.0分析数据，计数资料采用Fish确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

一  IV型胶原在膀胱尿路上皮癌组织的表达 免疫组化显示，内翻性生长尿路上皮癌基底膜IV型胶原染色连续完整，浸润性生长尿路上皮癌基底膜IV型胶原染色中断、不连续（见图1、2）。内翻性生长尿路上皮癌基底膜IV型胶原染色阳性40例，浸润性生长尿路上皮癌基底膜IV型胶原染色阳性4例，统计学分析显示内翻性和浸润性尿路上皮癌基底膜IV型胶原表达差异明显（P<0.01），见表一。

二  PASM-Masson染色在膀胱尿路上皮癌组织的表达  特殊染色显示，内翻性生长尿路上皮癌基底膜染色连续完整，浸润性生长尿路上皮癌基底膜染色中断（见图3、4）。内翻性生长尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色阳性42例，浸润性生长尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色阳性4例，统计学分析显示内翻性和浸润性尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色表达差异明显（P<0.01），见表二。

3讨论

膀胱尿路上皮癌病理学分型较多，内翻生长型尿路上皮癌是其特殊亚型，是一种少见的临床类型。国内外对其报道较少，由国外学者Amin[3]首次提出的一种名称。其病理生长方式常表现为内生性、膨胀性生长，伴或不伴周围基底样细胞的栅栏状排列。内翻生长性尿路上皮癌一般具有外生性生长成分，少见的病例不伴外生性生长成分表。它常见于中老年男性患者，通常表现为无痛性、间歇性、肉眼全程血尿，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。膀胱癌的预后与肿瘤分级、分期、肿瘤大小、肿瘤数目等因素密切相关，其中肿瘤的病理分级和分期是最重要因素之一[4]。膀胱癌的病理分期受肿瘤浸润程度的影响，进一步影响到患者预后评估。

日常病理中，内翻生长性尿路上皮癌与内翻性尿路上皮乳头状瘤在诊断中较好区分，内翻性尿路上皮乳头状瘤外观是外生性，无炎症，外覆盖正常上皮;上皮厚度、层次及形状与正常上皮相似（或局灶轻度异型）;少量非游离性乳头为特征。通过普通HE切片及免疫组化标记Ki-67、CK20等比较好鉴别。尤其是Ki-67特异性明显，相关文献显示，Ki-67在膀胱内翻性尿路上皮癌的表达有5%-8%，而Ki-67在内翻性生长的尿路上皮乳头状瘤的表达只有不到1%[5-6]。因此区分二者比较容易。内翻生长性尿路上皮癌表面常呈粗菜花状，上皮条索较宽，粗细不一，实性细胞巢不规则，细胞异型性明显。浸润性尿路上皮癌，常常呈浸润性生长，往肌层渗透，破坏组织结构，基底膜常不规则、断裂或者缺失。而内翻性尿路上皮癌和浸润性尿路上皮癌有时难区分，在诊断内翻性尿路上皮癌时，常通过HE切片观察细胞形态，肿瘤细胞团块跟组织间隙的关系，看肿瘤细胞是圆润的生长还是浸润破坏的生长，但此种方式不一定能够完全区分是否存在浸润。由于其生长方式跟浸润性癌一样，并且HE切片会产生误差，容易误诊为浸润癌。浸润性膀胱癌在发生微浸润或结构紊乱的癌组织，浸润癌的间质反应可缺如，炎症反应也可覆盖浸润区域，此时很难区分有无浸润。这些给临床病理诊断带来了一定的困难。研究发现，肿瘤侵袭破坏正常组织是一个复杂多步骤过程。基底膜在这里扮演了重要角色，基底膜作为正常组织和肿瘤组织之间的一层屏障，能够显示肿瘤细胞有没有发生侵袭和转移。文献显示，正常膀胱粘膜上皮基底膜常常是完整的，而在浸润性膀胱癌组织中基底膜常见缺损、断裂，甚至基底膜轮廓消失[7]。内翻性生长的膀胱尿路上皮癌，常未发生浸润，基底膜完整连续。由于其HE切片形态有时模棱两可，如果将其误诊为浸润性尿路上皮癌，会影响临床评估。内翻性尿路上皮癌的预后一般比浸润性尿路上皮癌好[8]。目前尚未见学者将IV型胶原和PASM-Masson染色用于内翻性膀胱尿路上皮癌的诊断应用，内翻性尿路上皮癌由于未发生浸润，其基底膜完整，我们创新首次将PASM-Masson和免疫组化（IV型胶原）双重标记内翻生长肿瘤外层基底膜，以此判断肿瘤有无突破基底膜发生浸润。

本研究结果显示，PASM-Masson和 IV型胶原标记基底膜效果明显。在内翻性生长尿路上皮癌组IV型胶原和PASM-Masson染色显示基底膜光滑而完整，着色清晰，呈连续性;而在浸润性生长尿路上皮癌组IV型胶原和PASM-Masson染色显示基底膜物质消失且出现缺口，甚至基底膜连续性断裂。经统计学分析，IV型胶原和PASM-Masson染色在内翻性生长尿路上皮癌基底膜阳性（共80例）表达率明显高于浸润生长组（共7例），IV型胶原和PASM-Masson染色在比较内翻性和浸润性生长尿路上皮癌表达差异明显，具有统计学意义（P<0.01）。表明IV型胶原和PASM-Masson染色有助于鉴别诊断浸润性和内翻性生长尿路上皮癌。

综上，在临床工作中，对于很难通过HE切片区分的膀胱尿路上皮癌内翻性生长和浸润性生长病例。运用IV型胶原和PASM-Masson染色辅助诊断这类型病例，极大提高了诊断的正确率，有助于临床评估。

参考文獻：

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