王辉,曾晓房,冯卫华,于立梅, 翟万京, 白卫东,曾令钢

1(仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州，510550) 2(广东中兴绿丰发展有限公司，广东 河源，517000)

柠檬苦素是含呋喃的三萜类化合物，分子式为C26H30O8，是一种具有高度生物活性的植物次生代谢产物[1],包括柠檬苦素糖苷和柠檬苦素糖苷配体在内的一系列化合物，已经分离和鉴定的柠檬苦素类化合物约50多种[2]。柠檬苦素具有抗癌活性、抑制HIV、镇痛抗炎作用、抗焦虑镇静作用、调节体内胆固醇水平、防止动脉粥样硬化形成、防虫杀虫活性、抗氧化活性和抑菌活性等功能[3-4]。章斌等[5]的研究表明，柠檬苦素对细菌有较好的抑菌活性。柠檬苦素在柑橘类植物的种子和皮中含量非常丰富，但目前国内对柠檬的加工利用大部分局限于柠檬鲜果、柠檬果汁及柠檬精油等，也有少部分拓展到加工柠檬冻干片及柠檬护肤品等，因此每年产生大量柠檬果皮废弃物[6]。如果柠檬果皮中的柠檬苦素能得到大量合理利用，提高其提取效率和使用途径，将具有广阔的工业前景。青霉广泛分布于自然界中，少数青霉种类能引发人体与动物的各类疾病，而多数青霉能造成柑桔、苹果、梨等水果的腐烂，青霉病是水果腐烂的最主要原因之一[7-8]。

因此，本文以青霉作为研究对象，探讨柠檬苦素对青霉的抑菌活性以及进行抑菌机理的研究。为开发柠檬苦素作为天然抑菌剂应用于食品领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器设备

柠檬皮粉，广东中兴绿丰发展有限公司；青霉(Penicilliumsp.)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)由仲恺农业工程学院轻工食品学院微生物实验室保藏；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基，广东环凯微生物科技有限公司；柠檬苦素标准品(纯度99.98%)，济宁天之蓝生物科技有限公司；碱性磷酸酶试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；考马斯亮蓝-G250、蒽酮，北京索莱宝科技有限公司；福林试剂(分析纯)，Sigma公司；石油醚、二氯甲烷及无水乙醇等均为国产分析纯。

扫描电子显微镜(JEOL-6360LV型)、冷冻干燥仪(JFD-320型)、离子溅射仪(JFC-1600型)，日本电子株式会社；精密数字式电导率仪(DDS-18A型)，上海日岛科学仪器有限公司；净化工作台(SW-CJ-1FD型)，苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱(PYX-280S-A型)，韶关市科力实验仪器有限公司；紫外分光光度计(UV-759型)，上海横摇科技有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器(DSX-280型)，上海申安医疗器械厂；冷冻水浴恒温振荡器(THZ-82型)，金坛市中大仪器厂；旋转蒸发仪(XHRE-52A型)，郑州豫华仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

柠檬皮中柠檬苦素溶液的制备：按照课题组前期的提取方法[9]，得到柠檬苦素结晶后，用少量15%乙醇溶解制成柠檬苦素溶液，-18 ℃保藏。

菌种活化和孢子悬浮液的制备：将保存在-20 ℃的青霉菌种在PDA培养基上活化2次后，用无菌生理盐水将孢子洗脱，制成孢子含量为108个/mL的孢子悬浮液，4 ℃冰箱保藏，备用。

柠檬苦素抑制青霉活性的测定：最低抑菌浓度(minimum inhibibory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration, MFC)的测定参考王巍等[10]和任先伟等[11]的方法，并略作修改。分别采用试管法和平板法测定柠檬苦素的MIC和MFC。取10支无菌试管，采用倍半浓度稀释法使8支试管中柠檬苦素质量浓度为10 000～78.125 μg/mL，1支试管为空白对照，不接种菌液，1支试管为菌液对照组，以等量无菌水代替柠檬苦素溶液。28 ℃培养2 d后，以试管中无青霉生长的最低柠檬苦素浓度为其MIC。MIC测定后，在无菌生长的试管中各取100 μL涂布于PDA平板培养基，28 ℃培养5 d后，以平板培养基上无菌生长的最低柠檬苦素浓度为MFC。

(1)

(2)

菌落间距/mm=菌落间距平均值-打孔器直径

(3)

(4)

1.3 柠檬苦素抑制青霉的机理

对青霉菌丝体总糖含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，28 ℃下150 r/min振荡培养5 d后，加入质量浓度为0、156.25、312.5、625、1 250、2 500 μg/mL的柠檬苦素溶液，继续振荡培养3 d后，过滤得青霉菌丝，用蒸馏水冲洗菌丝数遍后用滤纸吸干。按照蒽铜比色法[14]测定菌丝含糖量。以加入等量15%乙醇作为对照。

对青霉胞外可溶性蛋白含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，加入柠檬苦素使其最终浓度为MIC后，28 ℃恒温培养，分别于0、8、16、24、32、40 h移取孢子悬浮液，1 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL，采用考马斯亮蓝G-250 比色法[15]测定蛋白质的含量。以加入等量15%乙醇作为对照。

对青霉胞外碱性磷酸酶(AKP)活力的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，加入柠檬苦素使其最终浓度为MIC后，于28 ℃下150 r/min振荡孵育0、2、4、6、8、10 h后，1 000 r/min离心10 min，取上清液按照AKP试剂盒比色法测定和计算AKP活力[16]。以加入等量15%乙醇作为对照。

扫描电镜观察青霉菌丝体和孢子：取100 μL 106个/mL的青霉孢子悬浮液涂布在PDA平板培养基上，28 ℃恒温培养48 h后，用打孔器制得直径为4 mm的菌饼，将菌饼倒置在含有2倍MIC柠檬苦素的PDA培养基上，28 ℃培养48 h。用无菌的镊子将平板上的菌丝刮下后，经固定、脱水、干燥、喷金后镜检[17]。以加入等量15%乙醇作为对照。

1.4 数据的统计与分析

每个测定均重复3次。结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 22.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)中的One-Way ANOVA对所有数据进行方差分析，利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC影响

经试管法和平板法试验测定，柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC结果见表1。柠檬苦素对青霉的抑制活性最强，黑曲霉次之，根霉最弱。周梦娇等[12]研究了中草药对青霉的抑菌活性，其中抑菌活性最强的桂枝提取物对青霉的MIC和MFC为6.25和12.50 mg/mL，相比可知，柠檬苦素对青霉的抑菌活性很强。

表1柠檬苦素对霉菌的MIC及MFC单位：μg/mL

Table 1 The MIC and MFC of limonoids against mould

2.2 对青霉菌丝生长和孢子萌发的影响

由表2可知，柠檬苦素对青霉菌丝生长抑制的EC50值较小。由图1可知，柠檬苦素质量浓度为78.125 μg/mL时，对菌丝生长的抑制率已达44.20%，对孢子萌发的抑制率仅为27.00%；但随质量浓度升高至MIC(625 μg/mL)时，对孢子萌发的抑制率大于对菌丝生长的抑制率，并随质量浓度升高，两者差值越大。当柠檬苦素质量浓度达到2 500 μg/mL时，对青霉菌丝生长的抑制率和对青霉孢子萌发的抑制率分别为87.56%和98.31%，已基本完全抑制青霉孢子的萌发。因此，低浓度柠檬苦素对青霉菌丝生长具有较好的抑制效果，但高浓度柠檬苦素对青霉孢子萌发的抑制效果更佳。

表2 柠檬苦素对青霉的毒力回归方程和EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 oflimonoids against Penicillium

图1 柠檬苦素对青霉的菌丝生长和孢子萌发的抑制率Fig.1 Inhibition rate of limonoids on mycelium growth and spore germination of Penicillium

2.3 柠檬苦素抑制青霉的机理

2.3.1 对细胞膜通透性的影响

2.3.1.1 对菌丝体总糖含量的影响

当细胞膜膜结构遭到破坏时，细胞内容物包括糖类会发生外泄。菌丝体总糖含量的变化，可以反映细菌膜结构的完整性[18]。由图2可知，随柠檬苦素质量浓度增大，青霉菌丝体总糖含量显著下降(P<0.05)，但下降趋势逐渐放缓。当柠檬苦素质量浓度为MIC(625 μg/mL)时，菌丝体内总糖仅为未受柠檬苦素溶液处理的59.39%；当柠檬苦素质量浓度为MFC(2 500 μg/mL)时，菌丝体内总糖为未受柠檬苦素溶液处理的45.73%。因此，柠檬苦素可以对青霉细胞膜造成破坏，使菌体内总糖外渗，且处理浓度越大，破坏性越强。以上结论与周梦娇等[12]关于中草药能破坏指状青霉细胞结构，导致菌丝中总糖含量下降，从而达到抑菌效果的结论一致。

图2 柠檬苦素对青霉菌丝总糖含量的影响Fig.2 Effects of limonoids on total sugar content ofPenicillium注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05。

2.3.1.2 对胞外可溶性蛋白的影响

微生物生物膜的磷脂双分子层内镶嵌有大量蛋白质分子。当磷脂双层遭到破坏时，膜上的蛋白质将流到细胞外，且胞内的蛋白质也会流出。测定菌液中的蛋白质含量，可以看出磷脂双分子层是否被破坏[19]。由图3可知，经柠檬苦素处理的青霉菌液中蛋白质含量显著高于CK组(P<0.05)。柠檬苦素作用于青霉菌液后，作用时间为16 h内，尤其是前8 h，菌液中的蛋白质含量迅速上升，16 h后破坏作用趋于稳定。说明柠檬苦素在16 h时基本完成了对细胞膜破坏，导致蛋白质大量泄漏，影响青霉代谢活动的进行[20]。

图3 柠檬苦素对青霉胞外可溶性蛋白质的影响Fig.3 Effect of limonoids on extracellular soluble protein of Penicillium

2.3.2 对细胞壁完整度的影响

真菌细胞壁是一层重要而坚韧的保护层，在细胞壁和细胞膜之间存在一种叫碱性磷酸酶(AKP)的物质，正常情况下无法在胞外检测到该种酶的活性。一旦细胞壁遭到破坏，AKP将渗出至胞外。因此可以通过检测胞外AKP活力的变化来说明细胞壁的透性是否发生改变[21-22]。由图4可知，经MIC柠檬苦素处理的青霉培养液中AKP活力明显高于CK组(P<0.05)。MIC柠檬苦素作用后4 h内，菌液中渗出的AKP活力显著增强(P<0.05)。因此，柠檬苦素对青霉细胞壁的作用很快产生，4 h内基本破坏了青霉细胞壁，致使AKP酶外泄。

图4 柠檬苦素对青霉胞外AKP酶活力的影响Fig.4 Effect of limonoids on the activity of extracellular AKP enzyme in Penicillium

2.3.3 对菌丝和孢子形态的影响

由图5可知，经2倍MIC柠檬苦素(2×MIC)处理后的青霉形态与CK组相比发生较为明显的变化。CK组的青霉孢子(图5-A)呈现完整的球形，形态规则而饱满；而2×MIC组的青霉孢子(图5-B)欠饱满，有明显的皱缩和变形，外部附着溶出物。

图5 青霉扫描电镜图Fig.5 Scanning electron microscopy (SEM) of Penicillium

CK组分生孢子梗、梗基、小梗和分生孢子(图5-C)完好且生长旺盛；而2×MIC组的青霉(图5-D)可观察到，分生孢子生长不旺盛，小梗、分生孢子呈现明显的凹陷，严重皱缩和变形，各部分均有明显附着溶出物，可能是细胞凹裂而流出的物质。试验中也观察到青霉菌丝变细，其生长受到抑制，但不是很明显。这与柠檬苦素对抑制青霉活性的研究结果以及对细胞壁、细胞膜的影响结果一致。

3 结论

柠檬苦素对青霉有强抑菌活性。其抑制青霉的MIC值和MFC值分别为625和2 500 μg/mL；抑制菌丝生长和孢子萌发的EC50值分别为85.618 μg/mL和246.755 μg/mL。高浓度柠檬苦素对青霉孢子的萌发有较强的抑制作用，并能有效抑制菌丝生长。因此，柠檬苦素可以作为青霉抑菌剂加以应用。

柠檬苦素在较短的时间内迅速破坏了青霉细胞膜和细胞壁的完整性，并在4 h和16 h基本完成对青霉细胞膜和细胞壁的破坏，造成大量内容物渗出；而且柠檬苦素的浓度越高，内容物渗出量越大，即破坏性越大。扫描电镜观察到2×MIC柠檬苦素处理后，青霉的分生孢子生长不旺盛；孢子和小梗、分生孢子呈现明显的凹陷、严重皱缩和变形，有明显胞内物质溶出；菌丝形态也发生了一定程度的变化。这些变化影响了青霉胞内的正常代谢，进而抑制了青霉的生长和繁殖。