杨林毅 陈泽历 赖清玉

摘要：采用组织分离法对滇黄精（Polygonatum kingianum）病害样品进行病原菌分离，进一步通过柯赫氏法则进行验证并通过形态学观察和ITS 序列分析方法鉴定该病原菌。结果表明，病原菌菌株的菌丝为白色，背面淡黄色，菌丝体呈絮状、贴基生长、生长茂盛；病原菌菌株的分生孢子有两种形态，大型分生孢子呈镰刀形或柱形，小型分生孢子呈卵形或肾形；从菌株的形态学、致病性测定和ITS序列分析初步鉴定该菌为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。

关键词：滇黄精（Polygonatum kingianum）；腐皮镰刀菌（Fusarium solani）；分离鉴定

中图分类号：R931 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）03-0065-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.018 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： A pathogen from Polygonatum kingianum was isolated by pathogen isolation method， and identification of the pathogen was carried out by Koch's rule， morphological observation and ITS sequence analysis. The results show that the single colony mycelium of the pathogenic strain is white， the back is light yellow， and the mycelium is flocculent and flourishes. The conidia of the pathogenic strain have two forms， the large conidia are sickle-shaped or columnar， and the small conidia are oval or kidney-shaped. The pathogen was identified as Fusarium solani from the morphological， pathogenicity and ITS sequence analysis of the strains.

Key words： Polygonatum kingianum； Fusarium solani； isolation and identification

滇黃精（Polygonatum kingianum）又称节节高、仙人饭，植物界被子植物门单子叶植物纲百合目百合科黄精属草本植物，《中华人民共和国药典》[1]确定百合科（Liliaceae）多年生草本植物黄精（Polygouatum sibiricum）、多花黄精（P. cyrtouema）和滇黄精（P. kiugiauum.）为中药黄精的基原品种。滇黄精作为中药黄精的3个基源品种之一，以块大、色黄、润泽、断而透明的品质著称，主要分布在以云南省为中心的西南地区[2]。其根状茎味甘、性平，有补脾润肺、益气养阴的功能，主要用于治疗体虚乏力、心悸气短、肺燥干咳、糖尿病等[3，4]。滇黄精的主要病害有叶斑病、黑斑病、炭疽病、枯萎病、软腐病、青绿霉病、灰霉病、根腐病等[5-8]。目前在滇黄精研究方面多见有关化学成分的研究，而在病害方面很少有研究报道。为深入了解滇黄精病害的发生、发展规律和特点，为病害的有效防治提供较全面的依据，也为大面积推广滇黄精药材的种植，本研究就云南省曲靖市滇黄精的真菌病害和病原菌进行了分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

发病滇黄精植株采自云南省曲靖市，放于低温保鲜盒，带回实验室进行病原物分离。PDA培养基配方参照文献[9]。

1.2 方法

1.2.1 真菌病原物分离 在实验室采用组织分离法[9]进行病原菌的分离纯化：将新鲜的发病茎秆和块茎用自来水冲洗干净，用无菌手术刀将发病茎秆切成0.5 cm长的小段、将叶片切成0.5 cm×0.5 cm小块，在75%乙醇中浸泡40 s，随后在1% NaClO溶液中表面杀菌4 min，再在75%乙醇中漂洗30 s（去除残余NaClO），最后用无菌蒸馏水冲洗多次并用无菌滤纸吸干水分，移植于PDA培养基平板上，25 ℃黑暗条件下培养。培养基中预先加入氨苄青霉素（AMP）（100 mg/mL）以防止细菌的污染。培养4～5 d后，将从组织块边缘长出的菌丝转接至PDA培养基中进行纯化。

1.2.2 病原物形态学观察 将纯化的病原物接种在PDA或马丁氏培养基中，25 ℃黑暗条件下培养7 d，观察菌落形态和颜色，然后挑取菌丝，在光学显微镜下观察并照相记录菌丝结构和孢子形态特征[10]。

1.2.3 病原物的分子鉴定 分别刮取在PDA上培养7 d的病原菌菌丝，采用CTAB法提取DNA。

提取DNA之前要先保存菌种（平板保存1份，斜面2份），保存之前拍照。核糖体DNA内转录间隔区基因扩增采用通用引物ITS1和ITS4。PCR扩增反应体系为2×power Taq PCR masterMix 12.5 μL、ITS1（10 μmol/L）1μL、ITS4（10 μmol/L）1 μL、DNA模板（10 ng/μL）5.5 μL、ddH2O 5 μL。PCR扩增反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性40 S，55 ℃退火40 S，72 ℃延伸1 min，29次循环；最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。

PCR产物进行纯化后送铂尚生物技术（昆明）有限公司测序，将得到的序列在GenBank中进行对比，通过同源性分析对病原菌进行分子水平鉴定。

1.2.4 致病性测定

1）菌饼的制備。将纯化保存的菌株分别接种于PDA平板培养基中央，7 d后用灭菌的打孔器打取菌落边缘生长旺盛的部分获得菌饼待用。

2）菌饼离体接种。选取新鲜健康、大小基本一致的滇黄精块茎分成2组。用无菌束针刺伤，对其造成微伤口，2组均用75%乙醇轻轻擦拭对块茎进行杀菌。将上述菌株制备的菌饼分别贴在块茎接种部位，用潮湿且无菌脱脂棉包裹，同时打取不含菌的培养基作为对照。每隔2 d观察块茎的发病情况。

2 结果与分析

2.1 滇黄精病害症状

染病初期，块茎上出现不规则黑色病斑，中期随着病斑的继续发展，扩大逐渐连成一片。后期较为严重，整片病斑可使块茎失去水分和养分成为焦炭状，导致整个块茎腐烂，茎秆枯萎。如图1所示。

2.2 病原物的培养性状

分离、纯化得到的一株病原菌菌株在PDA培养基上表现为菌落正面白色，背面白色略带淡黄色，边缘不规则。如图2所示。

2.3 致病性测定

利用上述菌饼进行致病性测定，结果显示在28 ℃培养7 d后，接种菌块的滇黄精染病，症状与采集的病样相同，而空白没有染病。再次利用组织分离法从接种发病的块茎上分离该菌，于PDA培养基纯化获得真菌菌株，经过形态学观察、分子生物学鉴定和系统发育树构建，结果表明与接种之前的菌株性状相同，如图3所示。

2.4 病原菌的形态学鉴定

在PDA培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养7 d左右，病原菌菌株的单菌落菌丝为白色，背面淡黄色，菌丝体呈絮状、贴基生长、生长茂盛。病原菌菌株的分生孢子有两种形态，大型分生孢子呈镰刀形或柱形，小型分生孢子呈卵形或肾形（图4）。根据文献[10-14]及病原菌孢子形态，将分离得到的病原菌初步鉴定为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。

2.5 菌株的分子鉴定

病原菌PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示序列大约为500 bp。对该PCR产物进行测序，将测序得到的序列在NCBI Blast上进行比对，病原菌ITS序列比对得到片段大小为344 bp，并在NCBI Blast下载与该序列同源性最为接近的5条序列（表1），进一步结合MEGA7.0分子软件，采用邻接法构建系统发育树，发育树显示该序列与腐皮镰刀菌（Fusarium solani）同源性最高。相似度高达99%（图5），因此将该病原菌鉴定为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。

3 小结与讨论

3.1 小结

针对云南省曲靖滇黄精病害的发生现状，采用组织分离法对病害病原菌进行分离，经形态学和分子生物学鉴定及致病性测定，初步确定该病害为半知菌类从梗孢目（Moniliales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）镰刀菌属（Fusarium）的腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。本研究首次在滇黄精块茎上发现致病菌为腐皮镰刀菌（Fusarium solani），可为滇黄精病害防治提供较好的科学依据和技术支持。

3.2 讨论

近年来，随着市场需求量的增加，人们对滇黄精研究的不断深入，滇黄精的应用领域不断拓展，人工栽培滇黄精已成为市场供应的主体。但是，人工栽植面积的不断扩大加重了病虫的危害，严重影响滇黄精的产量和品质。目前为止，关于黄精病虫害的研究报道有杨子龙等[15]2002年报道的根腐病；刘殿辉等[16]2004年报道的叶斑病、黑斑病、菌核病；宋东平等[17]2004年报道的灰霉病；这些报道只是简单介绍了病害，都未对其致病病原菌做系统规范的报道。田启建等[6]2008年对贵州省黄精病害种类的研究结果表明，黄精苗期基本没有病害发生，其他生长期发生的病害有叶斑病、黑斑病、炭疽病、枯萎病、软腐病、青绿霉病、灰霉病等。叶斑病、黑斑病、炭疽病主要为害叶片造成斑点甚至枯死，黑斑病、炭疽病还为害果实，软腐病主要为害茎部。选育并种植抗病品种、加强水培管理、加强田间通风透光，及时清除枯枝病叶以及合理轮作等农业防治措施有助于减轻病害[15]。

镰刀菌属的生命力很强，在水、土壤、空气中均有分布。在空气中以分生孢子的形态存活，在土壤中长期存活的特性是其导致植物根腐病发病的主要原因之一。植物发病部位产生的分生孢子成为侵染源的一部分，借助雨水、空气进一步传播，危害植物。因此，作物的栽培管理制度对因镰刀菌导致的病害发生有着很大的影响。土质黏重、排水不良、多年连作容易导致病害的发生和流行。

滇黄精上的病害受各种因素的影响，所以发病情况也不一样。本试验采用组织分离法与单菌丝顶端挑取法对玉溪地区滇黄精真菌病害的病原菌进行了分离、纯化和鉴定，明确了生物学防治的对象，为病害防治提供了一定的理论依据。

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