何艺琴,卢晨,徐文杰,张兴,杨蕾,2,张慧丽,2,刘海峰,马东方,2,张长青

(1.主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，长江大学农学院,湖北 荆州 434025；2.植物病虫害生物学国家重点实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

小麦赤霉病(Fusariumhead blight，FHB)是全球范围内发生的小麦谷粒病，由镰刀菌属(Fusarium)和微小杆菌属(Microdochium)复合引起[1].其中最常见且最具攻击性的致病菌为禾谷镰刀菌—脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的一种高效生产者[2].DON是一种霉菌毒素，如果被人类和动物摄入体内，将对人类和动物的健康产生极大毒害作用，引起呕吐、腹泻、头晕的等症状,进而导致巨大的经济损失[3].华中及华南地区温暖潮湿，多雨多风，利于禾谷镰刀菌的生长及传播，故小麦赤霉病发生严重，探索行之有效的防治方法刻不容缓[4].

小麦赤霉病抗原少，抗病品种的研发周期长，虽然已经有一些抗病品种如苏麦系列、扬麦系列、陇春等，但是仍然没有获得突破性进展[5-6].防治赤霉病效果较好的化学药剂有氰烯.己唑醇悬浮剂、多菌灵与咪鲜胺的复配剂等[7].但由于化学药剂的长期使用，致使污染环境，危害人畜健康，且大量单一使用易导致抗药性[8].微生物生防菌剂属于环境友好型，利用微生物之间的拮抗关系及诱导植物产生系统抗性等进行防治，不存在产生抗药性的问题，有些微生物还可促进寄主植物的生长[9].从Hartely利用真菌微生物防治植物猝倒病开始，生物防治开始进入研究者的视野[10].

生产上广泛应用的细菌、真菌、放线菌等多从土壤中分离得到用以进行植物病害防治[11-12].土壤中也有很多小麦赤霉病的生防菌资源，目前已有很多相关报道.张雪娇等[13]从河北省十余县麦田土壤样品中筛选获得27株对小麦赤霉病菌有拮抗作用，拮抗效果好的菌株XJ-16的抑菌率达73.76%.李晓丹等[14]从石蒜根际土壤中分离得到7株小麦赤霉病的拮抗菌，并优化了其中一个菌株HH1的培养条件.土壤中已经开发出诸多植物病原拮抗菌，但直接从小麦组织中分离拮抗内生菌的报道相对较少.本研究在小麦赤霉病灾害区采集健康小麦植株进行内生菌分离，并将分离得到的拮抗菌进行培养条件优化.本研究通过从小麦内生菌中筛选得到优良拮抗菌株，旨在为小麦赤霉病菌的生防菌增添有用的新成员.

1 材料与方法

1.1 供试植物

于小麦灌浆期湖北省荆州市发生小麦赤霉病的农田里进行样品采集，采样，具体时间为2016年5月6日，按五点取样法采集健壮小麦数株，放入无菌袋中用于分离内生菌.

1.2 供试植物病原菌

小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、胶孢炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)均由长江大学农学院植物病原真菌与基因组学研究室提供.

1.3 内生细菌的分离纯化

将小麦的茎和叶剪成5 cm左右的小段，用流水冲洗30 min，无菌水冲洗4次后75%的乙醇浸泡5 min，无菌水冲洗2次，放入0.2%升汞中浸泡3 min，再用无菌水冲洗3次.将消毒后的植物材料放入盛有适量石英沙的无菌研钵中，加入10 mL无菌水研碎成汁液，用量程为100 μL的移液枪取100 μL的汁液涂布于PDA培养基和NA培养基上，28 ℃恒温培养.待长出菌落后挑取不同形态的菌落分别于PDA及NA培养基上培养.

1.4 小麦赤霉病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

采用平板对峙培养法[15]，在直径90 mm的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中央接种直径5 mm的小麦赤霉病菌，立枯病菌、白绢病菌、胶孢炭疽病菌和梨黑斑病菌5种植物病原真菌菌饼，在周围距离中心45 mm处接上分离纯化后的小麦内生细菌(图1)，以无菌水代替拮抗菌作为空白对照，每个处理设置3个独立的同等生物学重复，于28 ℃恒温培养3～4 d，待空白对照长满整个培养皿时，测量抑菌圈宽度，判断拮抗效果.

图1 离体拮抗试验Figure 1 The diagram of antagonism in vitro

1.5 拮抗菌XG-7的生物学特性研究

1.5.1 拮抗菌XG-7的部分生理生化特征鉴定 采用过滤灭菌法对葡萄糖、乳糖等待测碳源及牛肉浸膏、硝酸钾等待测氮源进行灭菌后，以1%的量分别加入灭菌后的碳源、氮源基础培养基中.移取0.1 mL菌液于各处理培养基内，37 ℃、161 r/min摇培，不接菌的培养基作为空白对照，每处理3次独立生物学重复.5 d后观察，培养液比空白对照浑浊则表明可利用该碳源或氮源.同理，对拮抗菌XG-7明胶液化、耐药性等特征进行检测[16].

1.5.2 拮抗菌XG-7培养条件的优化 接种1 mL的菌液到200 mL NA培养液中，37 ℃、161 r/min摇培，于接种后的前36 h，每隔4 h在625 nm波长下测菌液的OD值，36 h后每隔12 h测一次.以不接菌的NA培养液为CK，每处理3次独立生物学重复.以生长时间为横轴，以OD值为纵轴绘制生长曲线.

接种0.1 mL的菌液于100 mL的NA培养液(pH7.0)中，分别在4、10、16、22、28、34、40、46和52 ℃的恒温箱中161 r/min摇培，48 h后在625 nm波长下测其OD值.以不接菌的NA培养液为CK，每处理设置3次独立生物学重复.以处理温度为横轴，以OD值为纵轴绘制最适生长温度曲线.

NA培养液灭菌后用NaOH和HCl分别把pH值调至3.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、10.0、和12.0，接种0.1 mL菌液于不同pH值的100 mL的NA培养液中，37 ℃、161 r/min摇培，48 h后在625 nm波长下测其OD值.以不接菌的NA培养液为CK，每处理设置3次独立生物学重复.以处理pH为横轴，以OD值为纵轴绘制最适生长pH曲线.

1.5.3 拮抗菌XG-7耐药性测定 将5种常见抗生素氯霉素(Ch1)、氨苄青霉素(Amp)、四环素(Tet)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)分别配制成25、100、25、50、10 mg/mL的母液.分别取不同母液的抗生素0.2 mL于100 mL NA培养基中制成平板备用.取8 mm打孔器打菌块接种于含不同药的培养基上，28 ℃恒温培养箱培养2 d，观察测量菌落宽度大小，采用以下标准对其耐药性进行评价：0～8 mm无作用，9～17 mm弱作用，≥17 mm强作用.

1.6 拮抗菌XG-7的鉴定

拮抗菌株XG-7的基因组DNA通过改良的CTAB法[17]提取，并以提取成功的基因组DNA为PCR扩增模板.扩增引物为16S rDNA通用引物(正向引物：27F；反向引物：1492R)，对PCR扩增拮抗菌XG-7基因组DNA，PCR产物送华大基因公司测序.测序结果使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站)进行Blast比对，确定该拮抗菌株的种类.

2 结果与分析

2.1 拮抗内生细菌的筛选及拮抗谱测定

2.1.1 拮抗内生细菌的筛选 根据菌落形态和颜色等差异性，在小麦不同组织内共分离到60株细菌菌株.经过平板对峙法测定，从中共筛选出了7株对小麦赤霉病菌有拮抗作用的菌株，占所分离内生细菌总数的12%；其中，菌株的拮抗效果最好，抑菌圈的宽度达32.5 mm(表1).XG-7拮抗效果与CK形成鲜明的对比(图2).

表1 小麦内生拮抗菌及其来源

A．XG-7；B：对照CK.图2 拮抗菌株XG-7对小麦赤霉病菌的拮抗效果Figure 2 Antifungal activities of XG-7 against Fusarium graminearum on PDA plate

2.1.2 XG-7拮抗谱测定 从表中所示的抑菌圈宽度判断，XG-7菌株对4种供试病原菌的生长均有抑制效果(表2)，判断为广谱性拮抗菌.尤其对梨黑斑病菌的抑制效果最好.

2.2 XG-7生物学特性研究

2.2.1 XG-7拮抗菌株部分生理生化特征测定 测定结果表明，该菌株可利用碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖；可利用氮源有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸铵；可水解明胶、淀粉和水解酪素(表3).

2.2.2 XG-7拮抗菌株生长曲线 由图3可以看出，XG-7菌株在接种到NA培养液后的24 h内为对数期；接种24～60 h内为稳定期；60 h后进入衰退期.

图3 拮抗菌XG-7生长曲线Figure 3 Antagonistic bacteria XG-7 growth curve

病原菌Pathogen抑菌圈宽度/mmInhibition zone width平均值Average胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides28.229.029.028.733白绢病菌Sclerotium rolfsii30.633.434.032.667立枯病菌Rhizoctonia solani30.023.931.028.300梨黑斑病菌Alternaria kikuchiana39.029.833.434.067

表3 XG-7菌株的部分生理生化特征

“+”表示生长或反应阳性，“-”表示不生长或反应阴性.

“+” indicates growth or reaction positive，“-” indicates on growth or negative reaction.

2.2.3 XG-7拮抗菌株最适生长温度和pH 由图4以看出，10～50 ℃为可生长温度，28 ℃为最适生长温度；4.0～10.0为可生长pH值范围，pH在5.0～9.0时该菌适宜生长，8为最适pH值.

图4 拮抗菌XG-7最适温度和pH生长曲线Figure 4 Antagonistic bacteria XG-7 optimum temperature and pH growth curve

2.3 XG-7鉴定结果

测序结果显示，XG-7菌株的16S rDNA序列长度为1 509 bp.该序列在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站)BLAST进行比对，分析发现与XG-7菌株的16S rDNA同源性较高的均为芽孢杆菌，选取相似度较高、同缘关系较近的相关菌株的16S rDNA序列，用MEGA6软件构建系统发育树(图3).结果表明，XG-7菌株与枯草芽孢杆菌(h14，KX783533.1.)聚在同一分支上，结合其生物学特性，可将XG-7菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis).

2.4 XG-7拮抗菌株耐药性测定结果

测定结果显示，XG-7拮抗菌株对于氯霉素、氨苄西林钠2种抗生素表现极强的耐药性(图6、表4).

图5 拮抗菌株XG-7的系统发育树关系图Figure 5 Phylogenetic tree of strain XG-7 based on 16S rRNA sequence

A：氯霉素；B：链霉素；C：四环素；D：卡那霉素；E：氨苄西林钠；F：CK.A：Chloramphenicol；B：Streptomycin；C：Tetracycline；D：Kanamycin；E：Ampicillin Sodium；F：CK.图6 拮抗菌XG-7在加入不同抗生素的培养基中培养2 d天后的效果图Figure 6 Antagonistic bacteria XG-7 in different antibiotics added to the culture medium after two days renderings

抗生素Antibiotic用药浓度Concentration菌落宽度Colony width耐药性强弱Tolerance氯霉素 Chloramphenicol2539.1强链霉素 Streptomycin1008弱氨苄西林钠 Ampicillin sodium1020.3强卡那霉素 Kanamycin508弱四环素 Tetracycline2513.1弱

3 讨论

本研究从荆州小麦赤霉病重灾区采集健康小麦植株，并从中分离得到一株对小麦赤霉病菌有良好抗性的拮抗菌株XG-7，分析了16S rDNA序列、结合其生理生化特征初步鉴定为枯草芽孢杆菌，并对其生物学特性进行研究.

植物内生菌由De Bary提出，经过Carrol、Petrini、Kleopper、Wilson等的完善，目前为公众所接受的概念是生活在健康植株的各类组织并不会引起明显病害症状的有益微生物[18-21].植物内生菌可作为植物病害病原菌的生防菌，如Abdallah等从银叶茄中分离出2株内生细菌SV101、SV104，可防治番茄枯萎病；卢占慧等[22]从人参中分离得到97株内生菌，并从中分离到两株拮抗作用较强的生防真菌Psn87和Psn86；杨绍周等[23]从鼓槌石斛中分离得到33株内生菌，其中GB8和GB16抑菌效果极佳且具有广谱抑菌性.由此可见，植物内生菌是生防菌的高效资源库.本试验分离所得小麦内生菌XG-7对小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、立枯病菌、白绢病菌、梨黑斑病菌4种病原菌都有良好的拮抗性，且对于氯霉素、氨苄西林钠两种抗生素表现极强的耐药性.培养条件优化结果为：XG-7菌株在接种到NA培养液后的24 h内为对数期；接种24～60 h内为稳定期；60 h后进入衰退期.该菌株可利用多种碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖等；可利用多种氮源包括牛肉膏、酵母膏、硝酸铵、蛋白胨；28 ℃为最适生长温度；8为其最适生长pH.

XG-7为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，对环境、人畜均无害，被广泛应用于植物病虫害防治、提高畜禽的品质、环境治理、水体净化及发酵堆肥等多个研究领域[25-26].枯草芽孢杆菌作为生物防治中的重要成员，已经制成菌粉投入到实际应用中.张荣斌等[27]利用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病进行防治，研究发现防治效果十分显著，感病植株减少，植株单产量提高约10.9%，可实施性强，防治效果明显.

由于拮抗菌株XG-7是从小麦根中分离得到，且所有的试验均在实验室条件下完成，所以在实际生产实践中，XG-7产生的拮抗物质能否由根部传输到穗部进行定位防治，与XG-7在自然条件下能否发挥良好的拮抗作用对拮抗效果的好坏评估直接相关.以及拮抗菌株XG-7产生何种拮抗物质、如何产生、拮抗物质的各种理化性质尚不明确，有待于进一步研究.