丁心顺；翟丹云；何海宁

（甘肃省商业科技研究所有限公司，甘肃 兰州 730020）

无角陶赛特羊和特克塞尔羊都具有四季发情、产羔率高、羔羊初生重较大、肉用性状突出、耐粗饲及适应性强等优良的种质特点。目前，在大力提倡发展舍饲养羊业的同时，也存在一些客观的问题，如发展纯粹的舍饲养羊业，缺乏优良的肉羊品种和较低的繁殖效率；因此，通过建立经济杂交模式，引进国外优秀的肉羊种公羊（如无角陶赛特羊和特克塞尔羊）与我国地方绵羊品种交配，利用杂交优势[1]。通过现代分子育种技术结合经典育种方法，提高选种的精准度，加快遗传育种进展[2]。本试验以影响Invedal和Cambridge绵羊多胎性状的BMP15基因作为多胎候选基因，利用PCRSSCP技术，对无角陶赛特羊和特克塞尔羊这2个绵羊品种的BMP15基因第1外显子进行多态性分析，旨在探索该候选基因与无角陶赛特羊、特克塞尔羊繁殖性能之间的关系，为开展无角陶赛特羊和特克塞尔羊高繁殖力的遗传学基础研究提供科学依据，然后再进行分子水平的研究并且将研究成果应用到实际生产中，从而为选育出具有优秀繁殖性能和肉用性能特征的舍饲型绵羊提供理论依据，进而加快肉用绵羊遗传育种的发展进程[3]。

1 试验材料

1.1 试验动物

本试验以无角陶赛特母羊18只、特克塞尔母羊35只，共2个绵羊品种53个个体为研究对象。

1.2 试验器材

DNA提取试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker (DL2000)、PCR产物纯化试剂盒。

2 试验方法

2.1 试验动物血样样本的采集

颈静脉采血10 ml，ACD 抗凝，生物冰袋用保温盒低温运输，-70℃保存备用。样本量总计53只。无角陶赛特母羊18只，特克塞尔母羊35只。

2.2 全血基因组DNA提取

参照Saremi Mohammad Ali 等[4]方法，提取绵羊血液基因组DNA。

2.3 DNA检测

① 称取0.5g琼脂糖，量取50 ml 1×TAE缓冲液转入三角瓶中并混合均匀，加热溶解至溶液呈现清亮状态，然后加入2μL核酸染料，充分混匀待用。

② 把已经溶好的琼脂糖，晾至一会，使其温度达到60℃左右，将琼脂糖溶液倒入胶槽，插入合适的梳子，轻轻摇动，使凝胶液分布均匀。

③ 将琼脂糖置于室温中待其凝固，大约35～45 min，夏季气温高需要的时间稍长一些，待凝胶完全凝固后，把梳子轻轻拔掉，将凝胶轻轻放进电泳槽中，在电泳槽内加入 1×TAE缓冲液且要没过凝胶。

④ 将1μL 6×buffer与4μL DNA样品充分混合后加样，然后开始电泳，电压为90-150V电泳15～30 min。

⑤ 电泳工序结束后放在凝胶成像仪上，在紫外灯下观察、拍照。

2.4 PCR扩增

2.4.1 引物设计与合成 本试验根据GenBank已经发布的绵羊BMP15基因的DNA序列(登录号：NM-001114767)，利用引物设计软件Primer5设计1对特异性引物，引物由大连宝生物公司合成。引物序列、PCR产物大小及所在的位置见表1。

表1 BMP15基因第1外显子扩增引物序列信息

2.4.2 PCR最佳反应体系与反应程序（见2、表3）

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

2.4.3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测待测PCR产物上样量为3.5 μL，凝胶浓度根据Marker要求而定，其余步骤参考2.3。

2.5 聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）

（1）选择浓度适宜的聚丙烯酰胺凝胶要根据引物扩增片段的大小。（2）用蒸馏水清洗制胶用玻璃板和制胶架，烘干，装备玻璃板。（3）在清洗干净的锥形瓶内加入浓度适宜的丙烯酰胺、5×TBE缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED和超纯水，混匀后缓慢倒入已装备好的玻璃板之间，小心插入梳子，注意不要产生气泡，观察凝胶聚合情况，随时补加混合液。（4）凝胶聚合后，轻轻拔掉梳子，用注射器针吸取TBE缓冲液，冲洗点样孔，然后将玻璃板转移到电泳槽上，用铁夹子固定，在电泳槽中倒入1×TBE缓冲液。（5）250 V电压下预电泳20 min。（6）取3 ul PCR产物，加入8 ul变性缓冲液（98 %甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚兰、0.025%二甲苯青），瞬时离心，98℃变性10 min，立即置于冰水浴上，冰浴10 min后，全部点样于上述的非变性聚丙烯酰胺凝胶中。（7）在4℃中，180 V的电压下恒温恒压电泳14～20 h（具体情况见表5）。（8）电泳结束后，取出凝胶于瓷盘中，在凝胶上打孔做上标记。（9）用超纯水冲洗凝胶1次，在瓷盘中加入银染固定液，轻摇8～10 min，再用超纯水冲洗1遍。（10）加入银染染色液，轻摇5 min，再用超纯水冲洗2遍。（11）最后加入显影液，轻摇30s～1min。（12）待条带清晰后，倒出显影液，用超纯水冲洗2遍。（13）用保鲜膜将胶包裹好置于用紫外凝胶成像仪观察成像，分析基因型，拍照保存。

表4、5为各引物的SSCP分析条件。

表4 中性凝胶聚丙烯酰胺凝胶的组成

表5 中性凝胶聚丙烯酰胺凝胶浓度及电泳条件

2.6 PCR产物的纯化和回收与测序

随机挑选出3个PCR扩增产物利用PCR产物的纯化试剂盒进行纯化，送交生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

3 数据统计与分析

利用BioEdit和MEGA5.0分析扩增序列；利用PopGene32对样本各扩增片段的遗传信息进行分析。

4 结果

4.1 基因组DNA的提取及检测结果

本试验使用DNA提取试剂盒提取绵羊血液基因组DNA。所得基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。由图可知，各泳道条带清晰整齐，无拖尾现象，表明DNA提取良好，可直接用于后续试验。

4.2 PCR扩增结果

随机选取5份样，利用设计好的特异性引物扩增BMP15基因第1外显子，2%的琼脂糖凝胶检测，得到大小为307 bp的片段，与预期结果一致，且条带清晰、无杂带（见图2：1～5泳道），特异性良好，可以直接进行后续的SSCP分析。

图1 DNA检测结果

图2 BMP15基因第1外显子PCR扩增结果

4.3 SSCP检测结果

对不同个体的PCR扩增结果进行SSCP分析，结果见图3，BMP15基因第1外显子没有发现多态性，均为AA型。

图3 BMP15基因第1外显子SSCP检测结果

4.4 测序结果

随机选择3个PCR扩增产物，纯化回收后送交生工生物工程（上海）有限公司进行测序。测序结果显示（如图4），测序峰图清楚规整，结果可靠。在编码区第28～30位点没有发生碱基CTT的缺失，不存在多态性。

图4 BMP15基因第1外显子测序结果

5 分析与讨论

国内外对BMP15基因多态性的研究比较多，但主要集中在FecX、FecXH、FecXB和FecXG基因上，对BMP15基因第1外显子突变的研究比较少[5]。杨燕燕等[6]对蒙古羊以及小尾寒羊BMP15基因第1外显子的突变位点进行多态性分析发现，该突变位点在蒙古羊和小尾寒羊中均存在三种基因型，即野生型、突变杂合型以及突变纯和型，并且经过分析生产数据可知，BMP15基因第1外显子的突变不是影响小尾寒羊多态性状的候选基因，该结果同以前的研究结果一致，但结果提示该突变有可能是影响蒙古羊双羔群体繁殖性能的主效基因或与控制蒙古羊双羔性状的主效基因有着密切的关系。目前，对于影响无角陶赛特羊和特克塞尔羊双羔性能主效基因的相关研究和报道还很少。本试验利用PCR-SSCP方法，对无角陶赛特羊和特克塞尔羊这2个绵羊品种的BMP15基因第1外显子进行多态性分析，结果表明：在2个绵羊品种中均没有发现多态性，测序结果也表示，在编码区第28～30位点，没有发生碱基CTT的缺失，这与杨燕燕等[6]的研究结果有差异，可能是由于样本量较小，未能检测出突变个体，因此，还需要大量的研究来进一步确定BMP15基因多态性与绵羊繁殖性能的相关性。无角陶赛特羊和特克塞尔羊作为我国地方引进的国外优良肉羊品种，有必要对其种质特性进行深入研究，并在分子水平对其遗传规律和机制进行阐述，将对今后我国绵羊品种资源保护及生产利用具有特殊而重要的意义。

6 小结

利用PCR-SSCP技术对无角陶赛特羊和特克塞尔羊这2个绵羊品种的BMP15基因第1外显子进行多态性分析，结果表明：BMP15基因第1外显子在这2个绵羊品种中不存在多态性。