刘玉婷，李井雷

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥230009）

最近Daniel Granato等在Food Chemistry上发表了一篇短评，针对几种主流的体外抗氧化方法在评价食源性抗氧化材料中的作用进行了比较，同时指出虽然大部分体外抗氧化活性检测方法简便、价格低廉、具有高通量的特点，但是单纯依靠体外抗氧化实验很难全面评价食品生物材料的抗氧化作用，而且容易产生矛盾的结果，他们认为在体外抗氧化实验的基础上还要结合使用高效分析手段，例如高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）等分析方法，同时鼓励使用细胞检测手段、模拟消化检测或者是体内抗氧化检测方法综合评价食源抗氧化物质的抗氧化能力[1]。

多糖是食品中研究的主要对象之一，来源广泛，具有多种生物活性，其中研究较多的就包括多糖的抗氧化活性。在谷歌学术上以“antioxidant activity”和“polysaccharide”作为关键词搜索可以获得14万1千条搜索结果，如果按照年份进行统计的话，从2014年开始每年的论文发表量都稳步增加，2017年达到20200篇，截止到2018年6月份有13400篇相关论文发表（图1）。其中，中国学者发表的论文占了所有论文的大部分，近五年来稳定在70%～80%之间。同时，利用百度学术对中文文献（包括期刊论文、学位论文和会议论文）以“抗氧化”和“多糖”作为关键词进行搜索可以获得45 200篇论文，近五年的论文数量稳定在11 000篇左右（图2）。从论文数量以及中国学者发表论文占比上来看，无论是国内还是国外对于多糖的抗氧化活性都非常的关注，使得多糖的抗氧化已然成为食品、生物领域研究的热点话题。通过对文献的总结，针对多糖抗氧化活性主要是通过3种方式进行表征：体外实验、细胞实验以及活体实验。其中，由于操作简便，仪器设备要求不高，以及费用低廉等因素，体外实验在多糖抗氧化活性研究中占据了最大的比重，也被大部分研究人员广泛使用。

图1 谷歌学术中多糖抗氧化论文数量和中国学者论文占比情况统计（截止2018年6月）Fig.1 Statistics on the number of antioxidant polysaccharide papers in Google scholar and the proportion of Chinese scholars’papers（as of June 2018）

图2 百度学术关于多糖抗氧化中文论文统计（截止2018年6月）Fig.2 Baidu scholar statistics of Chinese papers on antioxidant polysaccharide（as of June 2018）

但是由于多糖分子量大、结构复杂、分离纯化难度大，使得采用体外实验来检测其抗氧化活性存在一定的困难，并且通用的多种体外抗氧化试验由于其试验方法的不同，可能适用于不同的对象和试验体系。以上种种原因使得多糖体外抗氧化活性结果之间缺乏对比，而且有时候产生矛盾的结果。因此，我们对近5年来关于多糖体外抗氧化活性的试验结果进行一个综述，主要目的在于通过文献的分析来比较不同体外抗氧化实验方法以及影响多糖抗氧化效果的主要因素，为后续的相关研究提供一定的基础和依据。

1 体外抗氧化主要方法

根据杨洋等的定义，抗氧化剂主要作为一种食品添加剂，主要作用是阻止或者延缓食品在加工、贮藏过程中因氧化而发生的营养损失、褪色、褐变等质量变化[2]。而根据B Halliwell等的定义，抗氧化剂是在低于易氧化底物浓度存在的情况下，可以有效抑制底物的氧化的物质[3]。抗氧化剂按照溶解性可以分为水溶性抗氧化剂和油溶性抗氧化剂，多糖属于水溶性物质，因此可以归为水溶性抗氧化剂。

抗氧化剂的抗氧化机理主要可以归纳为：消除活性自由基、消除非活性氧化因子、结合金属离子等，而影响多糖抗氧化活性的因素较多，可能包括多糖的来源、化学结构、分子量、纯度、空间构象等。针对多糖的体外抗氧化试验方法，基本上可以总结为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）活性自由基清除能力；2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulphonate），ABTS+·]活性自由基清除能力；·OH活性自由基清除能力；NO2-活性自由基清除能力；铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）；氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）；超氧阴离子自由基清除能力；NO·自由基清除能力；金属离子螯合能力；过氧化氢自由基抑制试验；总抗氧化能力；还原力；脂质过氧化抑制能力等。对于每一种方法具体的试验步骤和试验原理可以参照相关文献[4-5]，本文主要讨论以上各种方法在评价多糖抗氧化性上的适用性以及影响多糖抗氧化活性的主要因素。

2 主要体外抗氧化试验

2.1 DPPH·清除能力

DPPH·清除试验方法简单，经常被学者用于评价多糖抗氧化能力，文献报道中的具体试验方法会根据实际情况有所调整。DPPH法的工作溶液主要使用甲醇或者乙醇溶液配制，其最终反应体系中的水含量一般在0%～40%之间，大部分DPPH清除试验中水分含量低于20%[6-8]。而多糖属于高分子物质，易溶于水，而不溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，即使在含有部分水的DPPH工作溶液中，多糖也很容易析出，造成溶液浑浊。而大部分DPPH·清除试验的反应时间为10 min～30 min，在这个时间段，析出的多糖大部分还以悬浊状态存在于反应溶液中，在使用分光光度计来检测反应溶液的吸光值的时候极易对最终的结果造成影响，甚至产出错误的结果。因此，虽然部分活性多糖可以降低反应溶液的吸光值，表现出一定的抗氧化性，但可以通过对相关试验方法进行一定的修正来减少误差。由于多糖的分子量大小差异较大，但总体上反应体系中的多糖浓度较低，因此可以在反应结束后使用离心或者过滤的方式去除掉沉淀的多糖，而检测上清液或者滤液在517 nm的吸光值来计算其抗氧化活性。

曲伟等对龙井茶叶多糖进行了分离纯化，并检测了精制多糖、水洗脱部分多糖和甲醇洗脱部分多糖的DPPH·清除能力，结果说明龙井茶叶多糖及其结合物均具有较强的清除自由基的能力[9]。洪燕萍等对枇杷叶多糖进行纯化，并比较纯化前后的多糖的DPPH·清除能力，其结果显示利用大孔树脂纯化后多糖的纯度提高，而粗多糖中含有的蛋白质、酚类物质减少，同时抗氧化能力显著提高，说明多糖的纯度对于其抗氧化能力有显著的影响[10]。

2.2 ABTS+·清除能力

同DPPH·类似，ABTS+·可以和体系中存在的抗氧化物质结合而使反应体系褪色，通过检测反应体系在734 nm下的吸光值间接反应其抗氧化能力。试验过程和方法原理可以参照相关文献[11]。ABTS+·清除能力试验同样大部分在乙醇溶液中进行，反应溶液中乙醇的含量在70%左右[12]。因此，使用ABTS+·法检测多糖抗氧化活性依然面临多糖析出，影响吸光值结果的问题，在实际操作过程中需要对试验方法进行一定的改进。

2.3 ·OH清除能力

·OH是主要是通过Fenton反应来产生，然后利用·OH氧化邻二氮菲-Fe2+为邻二氮菲-Fe3+使溶液在530 nm处的吸光值降低，而多糖等抗氧化剂可以抑制·OH的氧化作用，通过检测溶液的吸光值可以间接反应其抗氧化活性[13-14]。该试验方法主要在水溶液体系中进行，不存在多糖析出的问题，而且通过对数据库中的相关文献数量进行对比也可以发现在评价多糖抗氧化方面，相比于DPPH·和ABTS+·清除能力，该方法使用更加频繁（表1）。

2.4 NO2-活性自由基清除能力

亚硝酸根离子在体内可以生成N-亚硝基化合物，后者具有较强的致癌性，因此部分文献将清除亚硝酸根离子的能力归为抗癌指标[15]，而更多文献中也把亚硝酸根离子清除活性归为抗氧化活性的范围[4，16-17]。

刘海英等对比平菇、杏鲍菇和白灵菇菌丝多糖对·OH、DPPH·和NO2-的体外清除作用，发现相同浓度下，多糖溶液对NO2-自由基清除能力最差，对DPPH·清除能力最大[18]。于淑池等比较了龙井茶多糖对自由基和NO2-自由基清除作用，发现龙井茶多糖可有效清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、NO2-，并且对NO2-清除能力最强[19]。梁少茹等制备了乙酰化修饰的绿茶多糖，并发现通过乙酰化修饰后多糖的对O2-·、·OH和NO2-体外清除活性显著提高，说明化学结构的改变会显著影响多糖的抗氧化活性[20]。

2.5 氧自由基清除能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）

ORAC法是一种常用的体外抗氧化能力检测方法，经常用于多糖的抗氧化活性体外检测，该方法具体的实验原理和方法可以参照相关文献[21]。Luca Casettari等比较多种不同修饰的壳聚糖的ORAC值，结果表明N-乙酰半胱氨酸修饰的壳聚糖抗氧化能力最强，没食子酸和水杨酸修饰的壳聚糖抗氧化能力紧随其后，同时指出ORAC值和总酚含量具有较强的相关性，说明多糖抗氧化活性可能与其分子链结合物质有关[22]。Baojun Xu等采用ORAC法和FRAP法检测不同来源和分子量的β-葡聚糖的抗氧化性，结果说明不同来源的β-葡聚糖的抗氧化性能明显不同，而且分子量也显著影响其抗氧化值，但分子量的影响没有显著的规律，这可能和多糖分子呈现的空间构象有一定的关系[23]。需要注意的是在2012年美国农业部将该方法从其网站上移除，理由为大量的证据表明ORAC值和任何活性物质以及人体健康没有关系[24]。

2.6 铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）

FRAP法主要通过检测Fe3+被体系中的还原物质还原为Fe2+的能力，因此FRAP法是一种还原力检测方法。如前所述，多糖的分子量可以影响其抗氧化能力，仇农学等利用超滤法将枸杞多糖进行了分离并检测其FRAP值，结果显示多糖的分子量对于其还原力具有一定的影响，但是不呈现明显的规律，还原力最强的组分为30 kDa～1 000 kDa的多糖组分，说明除了分子量还有其他的影响因素[25]。Hua-Bin Li等从49种可食用蘑菇中获得粗多糖并评估了其还原力以及抗氧化能力，结果显示粗多糖的抗氧化能力和其中含有的多酚含量有直接的关系，并指出多酚很有可能是这些可食用蘑菇抗氧化能力的来源[26]。Sheng-quan Huang的研究结果也显示，经过初步分离纯化的多糖还原力和抗氧化能力和多糖中糖醛酸以及蛋白质成分含量直接相关，印证了Hua-Bin Li等的研究结果[27]。

2.7 超氧阴离子自由基清除能力

超氧自由基一般利用邻苯三酚在弱碱环境下的自氧化来产生，通过检测特定波长下的吸光值来间接反应多糖物质的抗氧化能力[27]。有学者使用氯化硝基四氮唑蓝显色来检测抗氧化活性，但是使用该方法检测多糖抗氧化的研究较少[8，29-30]。唐军荣等检测了铁皮石斛多糖的体外抗氧化活性，结果显示铁皮石斛多糖对超氧阴离子自由基清除能力比VC还要高，说明铁皮石斛多糖具有较强的抗氧化能力[31]。Ellen C.Giese利用还原柠嗪酸产生超氧阴离子自由基，并用氯化硝基四氮唑蓝显色来测试超氧阴离子自由基含量，检测多种β-葡聚糖抗氧化性[14]。

2.8 螯合金属离子能力

通过螯合溶液中的金属离子，抑制金属离子的催化氧化自由基链式反应，达到抑制氧化作用的目的，因此可以检测多糖等抗氧化物质对于金属离子的螯合活性而检测其抗氧化活性。常用的检测方法是利用Fe2+，在菲啰嗪存在的情况下测试其在562 nm下的吸光值来确定多糖对金属离子的螯合作用[32]。多糖的其他抗氧化指标和螯合金属离子能力成正相关，但是具体的联系和金属离子敖合机理探讨的较少[33-34]。

3 多糖纯度与抗氧化能力

从天然物质中提取多糖需要经过提取-醇沉-脱蛋白-脱色-透析等步骤获得初步纯化的多糖，这时候获得的多糖可能还含有部分的蛋白质、多酚等杂质，同时获得的多糖很有可能是多种单一多糖的混合物，进一步分离纯化需要通过多种凝胶柱，根据多糖对不同凝胶材料的吸附能力不同进行分离纯化。

在多糖的分离纯化过程中，伴随着多糖纯度的提高，其中含有的杂质量减少，多糖的抗氧化活性也发生变化。从报道的研究结果中可知，和未经纯化的粗多糖相比，纯化后的多糖抗氧化活性可能提高，也可能降低，这可能与多糖的来源以及多糖的分子量、空间构象、单糖成分和链接方式等诸多因素有关。

赵玉红等使用采用DEAE-52离子交换层析和Sepharose CL-6B凝胶排阻层析分离纯化了鹿茸多糖，得到一种单一多糖，研究其抗氧化活性发现纯化后的多糖抗氧化活性比纯化前的粗多糖显著提高[35]。廉宜君等对甘草渣多糖、侯秀娟等对化橘红多糖、颜军等对银耳多糖的研究也显示纯化后的多糖比粗多糖显示出更高的体外抗氧化活性[36-38]。

然而，并不是所有的粗多糖的抗氧化活性都低于纯多糖，赵天湖等大叶冬青苦丁茶多糖进行研究，发现在相同浓度情况下，大叶冬青苦丁茶粗多糖抗氧化活性最强，显著高于其他纯多糖组分[39]。石学连等对浒苔多糖、何玲玲等对板栗多糖、聂凌鸿等对广东淮山水溶性多糖、李珊珊等对人参果多糖的研究也得到了类似的结果[40-43]。而刁文超等对南瓜多糖的研究表明南瓜粗多糖的抗氧化性和3种纯多糖相比处于中间水平，低于组分P11，但是高于组分P21，说明除了多糖的纯度，其他的因素也影响多糖的抗氧化能力[44]。

通过使用不同的溶剂提取获得不同的多糖组分也具有不同的抗氧化活性，陈蓉蓉等研究牛大力多糖的抗氧化活性，发现牛大力水提物的抗氧化能力最佳，其次是牛大力醇沉物，而牛大力粗多糖的抗氧化活性最差[45]。欧阳臻等使用50%和80%的乙醇沉淀金蝉花多糖并检测了其抗氧化活性，结果显示50%乙醇沉淀获得的多糖组分的抗氧化活性显著高于80%乙醇沉淀获得的多糖[46]。

4 多糖分子量与抗氧化活性

多糖分子量一般较大，而通过分离纯化后可以获得多个多糖组分，这些多糖组分的分子量有所不同。研究显示，相同来源的多糖分子量可能对于多糖的抗氧化活性产生影响。

潘莹等分离纯化冬枣多糖，得到分子量不同的2个组分，研究发现这2个多糖组分对羟自由基和DPPH·清除能力不同，分子量较大（3.02×105Da）的组分对自由基的清除能力显著高于分子量较小（1.04×104Da）的组分[47]。徐雪峰等对赤灵芝多糖的研究也得到了类似的结果，从赤灵芝粗多糖中分离获得了3种纯化多糖，并且发现分子量最大的多糖组分的抗氧化活性最佳[48]。而邵平等对海藻多糖的研究显示，中等分子量的海藻多糖抗氧化能力显著高于其他分子量的多糖组分[49]。罗建平等针对不同分子量的石斛多糖的体外抗氧化活性进行了研究，结果显示分子量较小（小于3.53×104Da）和分子量较大（大于 7.44×104Da）的多糖组分的抗氧化活性较强，说明石斛多糖的体外抗氧化能力与分子量具有直接的关系[50]。除此之外，其他的因素包括提取方法、提取时间、提取温度也会对多糖的抗氧化能力产生影响[51-53]。

5 结论

由于体外抗氧化试验具有实验方法简单、试验周期短、高通量获得数据等诸多优点，近些年成为了研究多糖生物活性的重要的检测指标。然而，研究人员在进行多糖抗氧化能力检测的时候需要针对多糖的性质选择合适的检测方法，全面而真实的反应多糖的抗氧化能力。在多糖体外抗氧化活性检测过程中，对于明显影响其最终结果的试验方法要根据实际情况进行改进，否则很容易获得错误的试验数据。

同时，对于多糖抗氧化活性的物质来源也需要进一步的探索。随着多糖的纯化过程，粗多糖中含量较多的蛋白质、酚类等物质将减少，而纯多糖组分含量上升，这势必会对多糖的抗氧化能力产生影响。目前，研究人员对于分离纯化如何影响抗氧化能力还没有确定的结论，因此有必要进一步阐释纯化对于多糖抗氧化能力的影响以及可能的作用机理。除此之外，多糖的分子量也显著影响多糖的抗氧化能力，但是这方面的研究依然比较欠缺。其他重要因素，包括多糖的单糖组成、糖苷键链接方式、多糖的空间构象等理化性质如何影响多糖的抗氧化能力也需要进一步的研究[54]。

大部分食品源活性多糖进入人体的过程都要经过消化道的消化过程，在这个过程中由于各种消化酶、消化液以及微生物的作用可能发生分子链的断裂、分子量的降低以及空间结构的改变，伴随这多糖理化性质的变化其抗氧化、抗炎症等活性也会发生显著的变化，并最终影响活性多糖的生物可利用度以及生物活性，因此多糖在消化过程中的活性变化已经引起了研究人员的关注，并逐渐报道这方面的研究结果[55-56]。

正如Daniel Granato等[1]指出的一样，针对多糖的抗氧化活性，单纯依靠体外试验显然是不足的，需要加强细胞抗氧化活性的方法研究和实践整理，同时对于多糖经过消化道如何被消化液消化处理，以及在大肠中如何被肠道微生物作用，以及是否发生分子链的断裂，产生何种主要组分，其抗氧化等活性如何，是多糖研究中需要特别注意的问题。