仇泓博，樊晓盼，吴晨燕，任小青

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384）

我国处于亚热带和温带地区，气温适宜，有利于河蟹的生长繁殖，河蟹养殖产量居世界第一[1]。河蟹味道鲜美，营养价值高，包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、磷、铁、VA、VB1、VB2、烟酸、蟹红素、蟹黄素等，是一种优质水产蛋白源[2]。蟹壳中含丰富的钙、多糖、甲壳素，具有良好的抗氧化作用[3]。目前河蟹常被加工成醉蟹、蟹肉罐头、蟹肉松、蟹油、蟹黄酱等[4-5]，但加工过程中个体较小或断肢残肢的低值河蟹无法得到有效的利用，直接丢弃，不仅造成蛋白资源的极大浪费，而且对环境造成严重污染[6]。

酶解是加工低值河蟹的一种有效渠道。酶解可以使河蟹中不易被利用的蛋白质转变为肽和游离氨基酸。食品加工过程中，原料中的蛋白质等含氮化合物在酶的作用下降解，可以产生特征风味物质，改善不良风味，更易被消费者接受[7]。陈启航等[8]利用木瓜蛋白酶对金枪鱼蒸煮液进行酶解，去除了腥味，制成一种鱼香浓郁的天然调味品。Li[9]用风味蛋白酶对罗非鱼进行酶解后，具有良好风味而没有任何异味。张永生等[10]采用复合蛋白酶和胰蛋白酶处理鸡肉，得到一类口感醇厚，持续性好的鸡肉香精。Suroukat[11]采用胃蛋白酶对鸡头骨蛋白进行酶解，确定了最佳酶解条件，并检测到酶解液中含有丰富的氨基酸，为肉味香料的制备提供了前体物质。Wei等[12]用碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解亚麻籽蛋白，得到的水解产物口感提升，苦味显著降低。

因此，本试验以低值河蟹为原料，对其先进行高压浸提，随后对高压浸提液进行酶解，以水解度和氨基态氮为评价指标，通过响应面优化风味蛋白酶和木瓜蛋白酶单独添加时的酶解条件，为进一步研究多酶复配酶解技术提供参考，为工业化生产蟹味香料提供理论和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低值河蟹：可可溢香（江苏）味业有限公司；风味蛋白酶（酶活500 LAPU/g）：丹麦诺维信酶制剂有限公司；木瓜蛋白酶（酶活2×105U/g）：广西庞博生物工程有限公司；氢氧化钠、酚酞、甲醛（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004精密分析天平：上海精科仪器公司；SX-500高压蒸汽灭菌锅：日本TOMY有限公司；THZ-98AB型恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹味香料制备

将洗净的河蟹放入沸水中烫漂3 min至外壳变红，取出沥干后绞碎。称取25 g绞碎的河蟹，按质量比1∶4的比例添加100 g水，在压力0.1 MPa、浸提温度120℃条件下浸提2 h得到河蟹蛋白浸提液；冷却后加入蛋白酶，恒温摇床上振荡酶解；沸水浴加热20 min使蛋白酶完全失活；过滤，得蟹味香料。

1.3.2 响应面优化试验

根据风味蛋白酶推荐使用条件即温度40℃～60℃、添加量为底物质量的0.01%～0.1%，木瓜蛋白酶推荐使用条件即温度50℃左右、添加量为底物质量的0.1%～0.3%，并结合实际需求控制反应时间，以蛋白水解度为响应值，采用软件Design Expert 10.0设计三因素三水平试验，分别对风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解时间、酶解温度以及酶添加量进行优化。因素水平及编码见表1和表2。

表1 风味蛋白酶响应面试验因素及水平编码值Table 1 Factor and levels in response surface methodology of flavourzyme

表2 木瓜蛋白酶响应面试验因素及水平编码值Table 2 Factor and levels in response surface methodology of papain

1.3.3 氨基态氮含量及水解度测定

氨基态氮含量：参考GB/T 12143-2008《饮料通用分析方法》以及赵新淮等[13]甲醛电位滴定法。

式中：V1表示样品加入甲醛后消耗NaOH溶液的体积，mL；V2表示空白对照组加入甲醛后消耗NaOH溶液的体积，mL；NNaOH表示NaOH溶液的浓度，mol/L。

2 结果与分析

2.1 风味蛋白酶响应面试验结果与分析

2.1.1 回归模型建立与显著性检验

风味蛋白酶响应面中心组合试验设计及结果见表3。试验后利用软件Design-Expert 10.0对上述试验结果进行多元线性回归分析，可建立水解度（Y）对酶解时间（A）、酶解温度（B）和酶添加量（C）的二次回归方程：

对试验所建立的回归模型进行方差分析结果见表4。P值=0.000 5＜0.01，达极显著水平；失拟项P值=0.801 0＞0.05，不显著，说明本试验所建立的回归模型拟合度较高，能够真实的拟合响应面。相关系数R2=0.957 3，说明采用响应面法所建立的回归模型回归效果较好。此外，通过比较回归方程中一次项系数绝对值的大小，可看出3个因素对风味蛋白酶酶解效果的主次顺序依次为：酶解温度（B）＞酶添加量（C）＞酶解时间（A）。

表3 风味蛋白酶响应面中心组合试验设计及结果Table 3 Central composite design scheme and results for response surface analysis of flavourzyme

表4 风味蛋白酶响应面试验回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

续表4 风味蛋白酶响应面试验回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

2.1.2 响应曲面和等高线图分析

3D图可以评价各因素间的交互作用，响应面图弯曲度越大，表明两因素交互越显著。等高线的形状可以更为直观的反应两变量的交互作用显著与否，等高线为椭圆形，则表示两变量交互作用显著[14-15]。

酶解时间与酶解温度对水解度的影响如图1所示，响应曲面弯曲度大，说明其两两之间的交互作用对水解度的影响是显著，即在酶解时间1.8 h～2 h，酶解温度45℃～47℃范围内，水解度处于最大值区域；酶解温度与酶添加量对水解度的影响如图2所示，即酶添加量0.08%～0.09%，酶解温度45℃～47℃范围内，水解度处于最大值区域。从等高线椭圆曲线来看，酶解温度和酶添加量存在更为显著的交互作用，在酶添加量一定时，酶解温度与水解度呈负相关关系，较低温度时水解度随酶添加量递增有升高趋势。酶解时间与酶添加量对水解度影响如图3所示，酶解时间与酶添加量响应曲面较平缓，等高线近似呈圆形，因此它们之间对水解度影响较低。

图1 时间、温度对DH影响的响应面图和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

图2 温度、酶添加量对DH影响的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperatureand and flavourzyme amount on DH of crab extract

图3 时间、酶添加量对DH影响的响应面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and flavourzyme amount on DH of crab extract

2.2 木瓜蛋白酶响应面试验结果与分析

2.2.1 回归模型建立与显著性检验

木瓜蛋白酶响应面中心组合试验设计及结果见表 5，以酶解时间（A）、酶解温度（B）和酶添加量（C）为自变量，水解度（Y）为响应值，对木瓜蛋白酶酶解试验结果进行多元回归分析，所建立的回归方程为：

对试验所建立的回归模型进行方差分析结果如表6所示，回归模型回归效果较好，能够用于预测木瓜蛋白酶对河蟹高压浸提液的酶解效果，3个因素对蛋白酶的酶解效果影响主次顺序依次为酶添加量（C）＞酶解温度（B）＞酶解时间（A）。

2.2.2 响应曲面和等高线图分析

木瓜蛋白酶酶解时间与酶解温度对水解度的影响如图4所示，酶解时间与酶解温度响应曲面弯度较大，表明时间与温度对水解度影响显著，在酶解时间一定时，随温度升高，水解度先升高后降低，在48℃～52℃之间达到最高值。可能是由于温度低于48℃，蛋白酶无法充分发挥功效，高于52℃，蛋白酶失活，也符合了所用木瓜蛋白酶最适温度为50℃左右这一设计响应面试验的前提条件；酶解温度与酶解时间对水解度的影响如图5所示，酶解温度与酶添加量响应曲面弯度最大，等高曲线呈椭圆形，表明两者间交互作用对水解度影响极为显著；酶解时间与酶添加量对水解度影响如图6所示，酶解时间与酶添加量响应曲面平缓，两者间交互作用对水解度影响较低，但在选定的范围内，水解度与酶解时间和酶添加量均呈正相关关系。

表5 木瓜蛋白酶响应面中心组合试验设计及结果Table 5 Central composite design scheme and results for response surface analysis of papain

表6 木瓜蛋白酶响应面试验回归模型方差分析Table 6 Variance analysis for the fitted regression equation of papain

2.3 验证与优化

分析回归方程Y1，得到风味蛋白酶的最佳酶解条件为：酶解温度47.657℃、酶解时间1.161 h、酶添加量0.084%，在此条件下预测水解度可达到10.697%，考虑到实际操作的可行性，将最佳工艺条件修整为酶解温度为47℃、酶解时间1.2 h、酶添加量0.08%。重复试验3次，测得水解度平均值11.08%；分析回归方程Y2，得到木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为：酶解温度52.991℃、酶解时间1.649 h、酶添加量0.059%，在此条件下预测水解度可达到10.269%，同理修整工艺条件为酶解温度为53℃、酶解时间1.6h、酶添加量0.06%，水解度平均值10.64%，实际测定值与模型预测值基本一致，可见该模型能较好地预测实际河蟹高压浸提液酶解过程中水解度的变化。

图4 时间、温度对DH影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

图5 温度、酶添加量对DH影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and papain amount on DH of crab extract

图6 时间、酶添加量对DH影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and papain amount on DH of crab extract

3 结论

基于响应面优化试验结果，得到风味蛋白酶最佳工艺条件为添加0.08%风味蛋白酶，47℃下酶解1.2 h，水解度可达11.08%；木瓜蛋白酶最佳工艺条件为0.06%木瓜蛋白酶，53℃下酶解1.6 h，水解度为10.64%，得到的蟹味香料色泽金黄，河蟹特征风味浓郁，无不良风味，可作为一类新型蟹味香料进行生产。下一步可将两种酶结合复配使用，是否会得到更好的效果有待研究。