鹿士峰，田淑雨，吴杨洋，杜秀菊

（聊城大学生命科学学院，山东聊城252059）

香菇（Lentinus edodes）是一种食药两用真菌[1]。香菇富有营养，香味浓郁，具有药用及滋补养生作用，被人们称为“抗癌新兵”、“蘑菇皇后”、“菌种之秀”[2]。研究表明，作为重要的生物活性成分，香菇多糖具有抗辐射[3]、降血糖[4]、抗菌抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]等多种药理活性。

提取多糖的方法有多种，热水浸提法为应用最广泛。随着应用技术的提高，微波辅助法、超声波辅助法、酶法等提取方法也应用到香菇多糖提取中。如魏桢元等[8]采用响应面优化法提取香菇多糖，得率为14.22%。吴佳慧等[9]利用混合酶技术提多糖，提取率达到了37.07%。王俊颖等[10]通过微波辅助法提取多糖，多糖提取率为8.72%。可见不同提取方法会对香菇多糖的提取产生影响。目前文献中缺少全面综合的对多种方法提取香菇多糖含量、单糖组成及抗氧化活性的比较。因此本试验采用热水法、酶法、超声辅助法和微波辅助法提取香菇粗多糖，探讨了不同方法提取所得香菇多糖的差异，希望为高效开发利用香菇多糖提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇子实体：市售；纤维素酶（酶活为3 U/mg）：美国Solarbio公司；标准单糖鼠李糖（L-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、果糖（D-Fru）、D-甘露糖（D-Man）、D-半乳糖（D-Gal）、D-木糖（D-Xyl）、D-氨基葡萄糖（D-Glu）、D-岩藻糖（D-Fuc）、D-葡萄糖醛酸（D-GlcA）、D-半乳糖醛酸（D-GalA）：美国 Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

WF-J2100型可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；KQ-100VDV型双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Sorvall Stratos离心机：德国Thermo Fisher；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；JY92-IIN超声波破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司；WP700TL23-K5格兰仕微波炉：佛山市格兰仕微波炉电器有限公司；FT/IR Scimitor 800：Varian，USA。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理

香菇子实体烘干，粉碎，过80目筛，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入90%乙醇浸提过夜，浸提2次，（2 700×g）离心15 min，残渣自然风干后备用。

1.3.2 香菇多糖的不同方式提取

1.3.2.1 热水浸提法

按照曾智平[11]的最优条件进行提取，并略作改动。取 1 g香菇粉（预处理后），按 1∶30（g/mL）的比例加入蒸馏水，90 ℃水浴，浸提 3 h，离心（2700×g）15 min，得多糖提取液。提取液浓缩过滤，加入4倍体积95%酒精，快速搅拌，4℃冰箱内冷藏过夜，离心干燥后得热水浸提香菇多糖（hot water extraction polysaccharide of Lentinus edodes，H-LEP）。平行试验3次，取平均值。

1.3.2.2 超声辅助提取法

按照孙亚杰等[12]的最优条件进行提取。取预处理干燥后香菇粉1 g，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，超声功率为580 W，超声温度64℃，提取1 h，提取液离心（2 700×g）15 min。之后按1.3.2.1中所述方法操作，所得超声提取香菇多糖（ultrasonic extraction polysaccharide of Lentinus edodes，U-LEP）。

1.3.2.3 酶提辅助提取法

按照李波等[13]的最优条件进行提取，并略作改动。取预处理干燥后香菇粉1 g，按1∶25（g/mL）比例加蒸馏水，纤维素酶浓度为0.25%，调节pH值至5.0，40℃提取1 h后升温到90℃灭酶活10min，提取液离心（2 700×g）15 min。之后按1.3.2.1中方法处理，所得酶提香菇多糖（enzyme extraction polysaccharide of Lentinus edodes，E-LEP）。

1.3.2.4 微波辅助提取法

按照刘小丽等[14]的最优条件进行提取，并略作改动。取预处理干燥后香菇粉1 g，按1∶20（g/mL）料液比加入蒸馏水，微波功率280 W，时间5 min，提取液离心（2 700×g）15 min。之后按 1.3.2.1 中方法处理，所得微波提取香菇多糖（microwave extraction polysaccharide of Lentinus edodes，M-LEP）。

1.3.3 多糖和蛋白质含量的测定

总糖含量检测采用苯酚-硫酸法[15]，还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法（3，5-dinitosalicylic acid，DNS法）法[16]，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[17]。多糖含量计算公式如下：

1.3.4 红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析

分别取2 mg的4种多糖样品进行红外光谱分析（KBr压片），FT-IR扫描测定范围为4 000 cm-1～400 cm-1[18]。

1.3.5 单糖组分分析

以 D-Glc，D-Gal，D-Man，L-Fuc，D-Xyl，D-GlcA，L-Rha，D-Glu，D-Fru，D-Ara，和 D-GalA 作为单糖标准，用高效阴离子交换色谱（high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）分析单糖组分。简述如下：取样品2 mg于三角瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）10 mL，110℃下静置 5 h后加入 3 mL甲醇真空旋转蒸发，干燥至恒重。加入蒸馏水定容到100mL，离子色谱仪进行单糖组分检测。洗脱条件为：洗脱液为浓度1 mol/L的NaAc和0.25 mol/L的NaOH的混合液，洗脱液流速为0.45 mL/min[19-20]。

1.3.6 抗氧化活性试验

1.3.6.1 多糖样品液的配制

称取样品（E-LEP、H-LEP、U-LEP 和 M-LEP）溶解配制成 62.5、125、250、500、1 000、1 500、2 000 μg/mL备用。分别以蒸馏水和抗坏血酸（Vc）作为阴性对照和阳性对照。

1.3.6.2 总还原力的测定

按顺序往试管中依次加入1 mL多糖样品液、2 mL 0.2 mol/LpH值为6.6的磷酸缓冲盐溶液和2 mL的1%铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴中反应20 min，迅速冷却后加入10%三氯乙酸溶液2 mL，离心（2 700×g，10 min），取上清液2.5 mL，加1 mL 0.1%的三氯化铁溶液和2.5 mL超纯水，混匀，静置10 min。在700 nm处测吸光值[21]。

1.3.6.3 DPPH自由基清除力的测定

1 mL样品液和1 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液混合均匀，避光静置30 min，517 nm波长处测吸光度值（Ai）；1 mL无水乙醇溶液与1 mL样品混匀，静置30 min，测吸光度值（Aj）；1 mL的无水乙醇溶液与1 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液混匀，静置30 min，测吸光度值（Ao）[22]。

DPPH自由基清除率（I）的计算公式为：

1.3.6.4 羟自由基清除能力的测定

依次加入4mmol/LFeSO4溶液1mL，1mL4mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL超纯水和1 mL 4 mmol/L水杨酸乙醇溶液混合均匀，室温下避光反应30 min，离心（2 700×g）10 min，510 nm 处测溶液的吸光度值为 A0。取1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 4 mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL样品液和1 mL 4 mmol/L水杨酸乙醇溶液混合均匀，按上述方法处理测得吸光度值为Ai。取1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 4 mmol/L 30%H2O2溶液，1 mL样品液和1 mL乙醇溶液混合均匀，按上述方法处理测得吸光度值为Aj[23]。

羟自由基清除率（I）计算公式：

2 结果与分析

2.1 不同方法提取的香菇多糖得率及糖含量的比较

蛋白质含量及多糖含量的测定标准曲线见图1，4种方法提取蛋白质及多糖含量及粗多糖含量见表1。

表1 M-LEP、H-LEP、E-LEP、U-LEP的得率及糖含量比较Table 1 Yield and sugar content of M-LEP,H-LEP,E-LEP and U-LEP

图1 总糖、还原糖及蛋白质的标准曲线图Fig.1 The standard curve of total sugar，reduce sugar and protein

热水浸提法的多糖提取率、总糖含量及多糖含量分别为4.76%、20.22%、18.13%。微波辅助提取法的多糖提取率、总糖含量及多糖含量最高，分别为9.48%、44.79、43.17%，而酶提辅助法的多糖提取率虽有所提高，为7.43%，但总糖含量及多糖含量与普通水提法相比有所降低，分别为15.37%、13.28%，较普通水提没有明显的提取优势。

2.2 FT-IR分析

FT-IR分析结果见图2。

图2 FT-IR分析结果Fig.2 The analysis results of FT-IR

通过傅里叶红外光谱分析仪鉴定4种多糖（MLEP、H-LEP、E-LEP、U-LEP）的结构特征，FT-IR 的4个红外光谱图峰形与峰位置相似，但峰强度有差异，说明4种方法提取物结构类型相似，但含量有差异。3 500 cm-1～3 200 cm-1处存在较强吸收峰，是由OH 伸缩振动引起。3 000 cm-1～2 800 cm-1和 1 400 cm-1～1 200 cm-1微弱吸收峰分别是由于C-H的伸缩和变角振动[24]，1 650 cm-1附近为酰胺基C=O伸缩振动[25]。上述波段处的吸收峰为糖类的特征吸收峰，表明4种样品均为多糖。1 250 cm-1～950 cm-1之间的强峰，是吡喃糖环的醚键（C-O-C）[26]，可以推测4种多糖均为吡喃糖。

2.3 单糖组分分析

多糖的组成成分和摩尔比对生物活性有很重要的作用[27]。采用甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等11种标准单糖样品作为参照，高效阴离子交换色谱鉴定单糖组分。分析结果见图3。

图311 种单糖的HPAEC-PAD光谱Fig.3 The spectra of HPAEC-PAD of 11 monosaccharides

通过对样品色谱图的保留时间与11种单糖标准品进行比对，发现4种不同提取方法得到的多糖其单糖组成比例各不相同。10种标准单糖的HPAEC-PAD图谱分析结果如图 3a，E-TAP、H-TAP、M-TAP 和 UTAP的单糖组分图谱如图3b～e。通过与单糖标准图谱（图3a）进行比对，发现酶辅助提取法得到粗多糖其单糖组成最多，有7种不同单糖。而水提、微波、超声所得粗多糖的单糖组成均为6种，热水提取法、微波法得到粗多糖其水解后不含氨基葡萄糖，超声法得到粗多糖其水解后不含木糖，可能是由于纤维素酶破坏了细胞壁组织，使多糖从细胞内大量溶出，从而使单糖种类相对增加。不同提取方法所得香菇多糖的单糖组成见表2。

由表2可知，D-葡萄糖是4种多糖（E-LEP、H-LEP、U-LEP、M-LEP）的主要组成组分，其摩尔百分含量分别为50.09%、48.95%、55.83%、49.92%。而U-LEP的D-葡萄糖醛酸含量明显高于其他3种多糖，为10.09%。

表2 不同提取方法所得香菇多糖的单糖组成Table 2 Monsaccharide components of various polysaccharides from Lentinus edodes

2.4 抗氧化活性

自由基极不稳定，会从邻近人体细胞内夺取电子，这种氧化现象会使细胞结构受到破坏。而羟自由基会使赖氨酸迅速损伤[28]，引起许多疾病，多糖的抗氧化作用通常用羟自由基清除能力来评估[29]。清除自由基能力反映着抗氧化水平的高低，而多糖有较强的清除自由基能力，所以从不同的提取方法中选取较强清除力的多糖就显得尤其重要。分别对4种多糖进行抗氧化活性鉴定，见图4。

图4 4种提取方式所得香菇多糖抗氧化活性Fig.4 The antioxidant properties of Lentinus edodes polysaccharide in four different extraction methods

由图4所示，在试验浓度范围内，其DPPH自由基清除力、羟自由基清除力、总还原力均呈浓度梯度依赖性，随着浓度梯度的增加，其抗氧化活性逐渐增强。4种提取方式提取香菇多糖抗氧化活性的EC50值见表3。

表3 4种提取方式提取香菇多糖抗氧化活性的EC50值Table 3 EC50values of antioxidant properties from Lentinus edodes polysaccharide in four different extraction methods

EC50值表3表明，H-LEP的DPPH自由基清除力最高，M-LEP的羟自由基清除力最高，总还原力近似相同。DPPH自由基清除力大小由强至弱排列顺序为：H-LEP＞E-LEP＞U-LEP＞M-LEP，羟自由基清除力大小由强至弱排列顺序为：M-LEP＞H-LEP＞U-LEP＞ELEP，总还原力由强至弱排列顺序为：H-LEP＞U-LEP＞E-LEP＞M-LEP。

3 讨论

本试验通过热水浸提法、超声辅助提取法、酶提辅助法、微波辅助提取法4种方法提取香菇多糖，并对其糖含量、蛋白含量、单糖组成及其结构特征进行对比分析，发现超声辅助提取法、酶提辅助法、微波辅助法的多糖提取得率及多糖含量较热水浸提法有所升高。通过HPAEC-PAD和FT-IR的方法鉴定4种多糖的化学组成及结构特征，发现4种多糖的单糖组成大体相似，但摩尔比例明显不同。试验结果表明，微波辅助提取法的粗多糖提取率及糖含量最高，分别为9.48%、43.17%。热水浸提法粗多糖提取率及糖含量仅为4.76%、18.13%，较热水浸提法而言，糖含量显著提高。且微波辅助法所提多糖有较强的清除羟自由基能力，其活性接近于阳性对照抗坏血酸。综合考虑4种不同提取方法所得多糖的提取得率、多糖含量及抗氧化作用，在热水浸提、超声辅助提取、酶辅助提取和微波辅助提取4种提取方法中，微波辅助为香菇多糖最优提取方法。