孔祥颖 甘富斌 高兴 张文华 蔡金山 李家奎

摘要：肝片吸虫病是一种由肝片吸虫和大片吸虫寄生于人和牛、羊等反刍动物的肝脏胆管所致的人畜共患寄生虫病。于2017年在青海省海北州某屠宰场进行牦牛寄生虫病调查时，在患病牦牛肝脏采集到吸虫样本，经虫体形态学观察、PCR鉴定，查明该虫体为大片吸虫，该研究为首次报道牦牛大片吸虫，可为牦牛该病的防治提供依据。

关键词：牦牛;大片吸虫;形态观察;PCR鉴定

中图分类号：S852.73+5        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2019）01-0005-02

肝片形吸虫病是一种以肝片吸虫和大片吸虫为病原的重要的人畜共患寄生虫病，主要寄生于动物的肝脏、胆管、胆囊中，以破坏动物肝脏、胆管而引起急性、慢性肝炎和胆管炎[1]，并使患病动物伴有贫血、水肿、食欲不振、全身性中毒等症状，轻者可导致患病动物消瘦，重者可导致患病动物大批死亡，给养殖业造成严重的经济损失[2，3]。

牦牛主要分布于我国的青藏高原及毗邻地区，适应高寒生态条件，耐粗、耐劳，善走陡坡险路、雪山沼泽，能游渡江河激流，有“高原之舟”之称[4，5]。当牦牛采食沼泽、潮湿、坑洼等草地的牧草时，容易感染肝片吸虫病，造成牦牛大量死亡，给牧民带来较大的经济损失[6，7]。笔者在青海患肝片吸虫病牦牛身上采集到虫体样本，经压片观察、PCR鉴定后，确认为牦牛大片吸虫，该研究将为牦牛大片吸虫病的诊断提供参考[2，8，9]。

1  材料与方法

1.1  试验用虫体来源

2017年自青海海北州某屠宰场进行牦牛寄生虫病调查时，在牦牛肝脏中采集到虫体样本，疑似肝片吸虫，经95%的乙醇固定，待检。

1.2  DNA提取

将虫体用研钵磨碎，加入裂解液使细胞充分裂解，用氯仿提取DNA，以氮吹仪吹干，最后再溶解，于4 ℃保存。

1.3  PCR方法

扩增的引物是Itagaki等所发表的引物，上游引物为5′_AAGGATGTGCTTTGTCGTGG_3′，下游引物为5′_AGGCCCCTTACGAATCTGCAT_3′。反应体系为25 μL，其中蒸馏水5.5 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循环，最后72 ℃后延伸5 min。取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，观察并记录结果。最后将扩增产物送到擎科生物科技有限公司测序，并将测序结果在NCBI上进行比对。

2  结果与分析

2.1  牦牛大片吸虫的形态观察

眼观和显微镜观察，牦牛大片吸虫虫体长37～76 mm、宽5～10 mm，竹叶状。与肝片形吸虫的区别在于：前者前端无显著的圆锥突出，在头部后面即逐渐扩大直至腹吸盘水平处，虫体的边几成平行，后端不缩小;腹吸盘较大，其腔通常向后延长，并形成盲囊。大片形吸虫的咽较食道长，肠管的内侧分支很多，并有明显的小支，睾丸分支较少，所占的空间及其长度较小。牦牛大片吸虫形态和报道的大片吸虫形态相似[10]。

2.2  测序结果及NCBI GenBank比较

经扩增得到514 bp的片段，G+C含量为38.3%。同NCBI GenBank已发表的序列进行比较发现，与KF543343.1、MF430857.1等相似度达到99%，与KF687892.1相似度更是高达100%（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）[11]。可以确定该虫体样本为大片吸虫。

3  讨论

牦牛肝片吸虫病是由肝片吸虫和大片吸虫引起的一种寄生虫病，严重影响牦牛的生长发育，甚至引起大批死亡[12，13]。该病在我国牦牛产区十分常见，常造成较大的经济损失[14]。但在以往的报道中，肝片吸虫病多由肝片吸虫引起，大片吸虫少有报道。目前已见报道的牛的大片吸虫仅有水牛，本试验证实了牦牛体内大片吸虫的存在，为牦牛大片吸虫的诊治奠定了基础。

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