焦士蓉,唐子尧,孙博瑞,姚 瑶,王 周,阴文娅,马思思

(1. 西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039; 2. 东京大学医学部，日本 东京 113-8655;3.四川大学公共卫生学院，四川 成都 610065)

肥胖已经成为世界性的流行病，可引起肾衰、脂肪肝、高血压和某些癌症[1-2]。肥胖的生成，与遗传、环境及饮食习惯密切相关，特别是高能量饮食是导致肥胖的重要原因。除控制食用高脂饮食外，采用药物治疗肥胖症也成为了重要手段；但可用于临床治疗的药物少，且有毒副作用[3]。人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)，存在于成熟的脂肪组织中，可通过分化、增殖生成脂肪细胞，而脂肪细胞的增加与脂肪组织体积的增大，可形成肥胖[4]；因此研究如何通过抑制脂肪细胞的增殖与分化，维持脂肪组织内脂肪细胞数量的动态平衡，而达到抑制肥胖及相关疾病的目的，显得尤为重要。Shiwani S等[5]的研究表明，多酚类物质可以抑制脂肪细胞和诱导脂肪细胞凋亡。石榴皮以其高含量的酚醛化合物、鞣花单宁、原花青素、复合多糖、黄酮类化合物等成分，表现出强的抗诱变、抗氧化、抗菌和抗凋亡特性[6-9]。May NAM等[10]的研究表明石榴及提取物对于预防和治疗肥胖都有潜在的作用。同时鞣花酸为石榴皮中鞣花单宁的水解产物，研究表明鞣花酸对脂肪细胞有抑制作用[11]。但关于石榴皮及鞣花酸对人脂肪干细胞增殖及分化的影响的研究少有报道。本研究旨在探讨石榴皮提取物及鞣花酸对人脂肪干细胞增殖及分化的影响，为预防和治疗肥胖，为石榴皮资源的开发提供依据和线索。

1 材料与方法

1.1 实验主要材料

DMEM/F12(1 ∶1)培养基、青霉素-链霉素溶液(美国HYCLONE公司)；胎牛血清(FBS,美国Giboc公司)；Ⅰ型胶原酶、油红O染色剂、胰蛋白酶、医用地塞米松注射剂(Dex)、人类重组胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司， 鞣花酸(MUST14031010，≧98%(成都曼思特生物科技有限公司)；其余试剂均为分析纯试剂。

1.2 石榴皮提取物的制备

石榴皮购买自成都中药饮品有限公司。石榴皮的提取物方法及成分测定参考文献[12]的方法

1．3 实验方法

1.3.1 原代人脂肪干细胞的分离与培养[13-14]

通过经患者同意的乳腺切除手术获得健康乳腺脂肪组织， 500 U·mL-1双抗的PBS，无菌条件下漂洗3遍，剪碎成1.0 mm3的组织块，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，120 r·min-1，37 ℃消化60 min，加入DMEM/ F12培养液终止消化，1 200 r·min-1离心5 min，取下层脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀，加入完全培养基重悬细胞沉淀，200目过滤，以1×104～5×104个·cm-2接种至培养瓶中，于37 ℃，5%CO2培养箱孵育48 h后换液，以后每3 d换液1次。原代培养生长融合达到90%，采用0.25%胰酶消化后，1 ∶3传代接种到新的培养瓶中持续体外扩增培养，采用P3-P7代细胞进行实验。

1.3.2 石榴皮提取物、鞣花酸对hADSCS增殖的抑制作用[13]

采用96孔板，每孔加入200 μL的完全培养液，稀释密度为5×104个cells·mL-1hADSCs，37 ℃，5%CO2的条件孵育至细胞完全融合，弃去上清液。每孔加入200 μL分别含有25、5、1 μg·mL-1的石榴皮提取物；1.5、3.0、4.5 μg·mL-1鞣花酸的成脂诱导培养液(DMEM/F12，10%FBS，100 U·mL-1青霉素-链霉素溶液，1 μmol·L-1Dex，5 μmol·mL-1人医用胰岛素，0.2 mmol·L-1吲哚美辛，0.5 mmol·L-1IBMX),同时设诱导培养液+DMSO 0.1%为对照组，完全培养液+DMSO 0.1%为空白组，每组6个复孔。每3 d换一次液，经14 d诱导分化后，用MTT法测定，540 nm波长下测定其吸光度A值，分别计算不同浓度石榴皮提取物(PoPE) 和鞣花酸(EA)对融合期hADSCS增殖的相对抑制率，公式如下：

相对抑制率=[(A1-A0)-

(A2-A0)]/ (A1-A0)×100%

式中:A0为空白孔的吸光度平均值；A1为对照组的吸光度的平均值；A2为各干预组的吸光度平均值。

1.3.3 石榴皮提取物、鞣花酸对hADSCS分化的抑制作用[13]

采用油红O染色法, 观察石榴皮提取物及鞣花酸对hADSCS分化能力的影响。采用24孔板，每孔加入1 mL培养液，细胞接种密度为1×105个·孔-1，37 ℃，5%CO2孵育培养至细胞完全融合，弃去上清液。每孔分别加入含有25、5、1 μg·mL-1的PoPE和4.5、3、1.5 μg·mL-1EA的成脂诱导培养液, 进行诱导分化，并设置对照组(诱导培养液+DMSO 0.1%)、空白组(完全培养液+DMSO 0.1%)，每组设置3个复孔。每3 d换一次液，经14 d的诱导分化，倒置显微镜下观察其形态学变化，用油红O染色法测定甘油三酯的相对含量，490 nm波长下测定其吸光度A值。公式如下：

相对抑制率=[(A1-A0)-(A2-

A0)]/ (A1-A0)× 100%

式中:A0为空白孔的吸光度平均值；A1为对照组的吸光度的平均值；A2为各干预组的吸光度平均值。

2 统计学方法

3 实验结果与分析

3.1 石榴皮提取物及鞣花酸对人脂肪干细胞增殖的抑制情况

如图1所示，与对照组相比较，石榴皮提取物质量浓度为25、5、1 μg·mL-1时，其对hADSCs的抑制率分别为31.87%、15.18%、13.99%，中、低浓度间没有显著性差异，与高浓度间有显著性差异(P<0.05)。鞣花酸质量浓度为4.5、3.0、1.0 μg·mL-1时，其对hADSCs的抑制率分别为47.23%、23.59%、15.77%(P<0.05)。

由图1可知，石榴皮提取物及鞣花酸对hADSCs的增殖均有抑制作用，且成剂量效应关系，另鞣花酸的抑制浓度显著低于石榴皮提取物，也说明鞣花酸为有效活性物质。

图1 石榴皮提取物和鞣花酸对人脂肪干细胞增殖的抑制作用

3.2 石榴皮提取物、鞣花酸对hADSCs分化的抑制情况

加入诱导剂的第二到第三天，脂肪细胞中开始出现细小脂滴，随着时间增加，脂滴呈串珠或戒环状不断增大。诱导14 d以后，形成成熟脂肪细胞，脂滴变圆且形状饱满，经油红O染色后，脂滴呈红色，如图2、图3所示。

(从左至右：空白、对照、1、5、25 μg/mL)

(从左至右：空白、对照、1.5、3、4.5 μg·mL-1)

从图2、3中空白与对照及PoPE和EA组可以看出，正常梭形细胞形态发生改变，变为类圆形或多边形，细胞内积累脂滴，经油红O染色，PoPE和EA处理组脂肪粒的数量与对照相比，脂滴的数量和面积明显减少，并随着处理组浓度的增加，对脂滴形成的抑制作用显著增加。

如图4所示，石榴皮提取物为25、5、1 μg·mL-1时，与正常诱导对照组相比，其对hADSCs分化能力的抑制率分别为45.88%、24.30%、21.24%，中、低间没有差异，与高浓度具有显著性差异(P<0.05)。与正常诱导对照组相比，鞣花酸4.5、3.0、1.5 μg·mL-1时，其抑制率分别为44.96%、34.88%、28.23%(P<0.05)。

图4 石榴皮提取物和鞣花酸对人脂肪干细胞分化的抑制作用

4 结论

肥胖已经成了世界性的健康问题, 肥胖是由于个体能量的吸收大于消耗而引起的。从细胞水平考虑, 是由于单个脂肪细胞体积增大或脂肪细胞的数目增多而引起的。本研究表明, 在一定剂量范围内, 石榴皮提取物与鞣花酸能够剂量依赖性地抑制hADSCs的增殖与分化，减少脂肪细胞内甘油三酯的累积，可望开发为减肥降脂的纯天然药物。