吴 静，东保吉，吴 超

抗病毒治疗慢性丙型肝炎（CHC）患者的疗效受多种因素的影响，其中基线血清HCV RNA水平就很重要[1]。一般认为，CHC患者血清病毒水平越低，则治疗疗效越好，治疗效果也会受到HCV特异性细胞毒性 T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）活性的影响[2]，该特异性T细胞能够清除HCV，提高治疗效果[3]。本研究检测了180例CHC患者外周血滤泡辅助性 T淋巴细胞（follicular helper T cells，Tfh）表面程序性死亡受体-1（programmed cell death-1，PD-1）的表达情况，并检测了血清白细胞介素21（IL-21）水平，以探讨不同血清病毒载量的CHC患者外周血Tfh细胞表面PD-1表达的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年8月～2017年8月在我院就诊的CHC患者180例，男119例，女61例；年龄为22～59岁，平均年龄为（47.31±9.65）岁；平均病程为（7.5±3.14）年。符合丙型肝炎防治指南的诊断标准[4]。纳入标准：血清HCV RNA≥3 lg copies/ml，人类白细胞抗原（HLA）-A2阳性。排除标准：合并其他肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒感染、有自身免疫性疾病史、嗜酒史、应用肝毒性药物、应用过口服抗病毒药物、α-干扰素和免疫调节剂者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 检测方法 采用荧光定量PCR法检测血清HCV RNA（试剂购于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用ELISA法检测血清抗-HCV（试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司）；使用日立7600全自动生物化学分析仪检测血生化指标；使用贝克曼库尔特公司生产的FC500流式细胞仪检测外周血T、B淋巴细胞亚群、白细胞HLA-A2等位基因型、外周血Tfh和Tfh细胞表面PD-1阳性率（试剂盒均购于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素21（IL-21，试剂盒购于武汉博士德生物有限公司）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件，计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组检测指标比较 根据血清HCV RNA水平进行分组，结果血清低病毒载量组76例，3 lg copies/ml≤血清 HCV RNA＜6 lg copies/ml；高病毒载量组104例，血清HCV RNA≥6 lg copies/ml。高病毒载量组Tfh细胞表面PD-1阳性率显著高于低病毒载量组（P＜0.01），而Tfh细胞百分比和血清IL-21水平均显著低于低病毒载量组，差异有统计学意义（P＜0.01，表 1）。

2.2 两组外周血T、B细胞百分比比较 高病毒载量组外周血CD4+T、CD4+T/CD8+T比值和CD19+B细胞百分比均显著低于低病毒载量组，而外周血CD8+T细胞百分比显著高于低病毒载量组，差异有统计学意义（P＜0.01，表 2）。

表1 两组检测指标（%±s）比较

表1 两组检测指标（%±s）比较

例数 HCV RNA（lg copies/ml） Tfh细胞表面PD-1阳性 Tfh细胞百分比 IL-21（ng/L）低病毒载量 76 4.5±1.2 26.2±2.2 7.9±0.7 46.8±1.3高病毒载量 104 6.4±0.7 37.2±1.1 5.1±0.4 21.7±1.1 t 9.216 35.368 21.496 105.534 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 两组外周血T、B细胞（±s）比较

表2 两组外周血T、B细胞（±s）比较

例数 CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+T/CD8+T比值 CD19+B（%）低病毒载量组 76 51.1±4.6 24.0±3.1 3.3±0.2 16.7±3.9高病毒载量组 104 37.6±4.4 31.7±3.9 2.3±0.1 11.8±3.2 t 13.492 10.923 26.192 6.761 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 两组外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1阳性表达百分比的比较 高病毒载量组CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1阳性百分比均显著低于低病毒载量组，差异有统计学意义（P＜0.01，表 3）。

表3 两组外周血CD4+和CD8+T细胞表面PD-1表达（%±s）的比较

表3 两组外周血CD4+和CD8+T细胞表面PD-1表达（%±s）的比较

CD8+T细胞PD-1阳性低病毒载量组 76 10.1±2.3 6.3±2.2高病毒载量组 104 2.4±0.6 1.0±0.3 t 26.640 18.413 P＜0.01 ＜0.01例数 CD4+T细胞PD-1阳性

3 讨论

Tfh细胞主要在T淋巴细胞亚群中起作用，同时其本身还能够通过分泌IL-21使病毒激活细胞毒性T淋巴细胞，使慢性乙型肝炎患者能够获得持续的抗病毒免疫[5]。Meissner et al研究表明，滤泡辅助性T细胞在慢性HCV感染性疾病发病过程中参与免疫反应应答[6]。Tfh表面存在一种PD-1受体，这种分子能抑制Tfh细胞表面分子的表达。在这种条件下，IL-21和HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）将无法更好地发挥作用，清除HCV的能力受到阻碍[7]。

慢性HCT感染患者外周血CD4+T细胞的效应降低，而CD8+T细胞功能相对增强，该反应变化与HIV感染患者类似[8]。T淋巴细胞发挥持续应答需要接收到三个信号：一个是通过T细胞释放的应答因子传递；二是通过T细胞受体传递；三是通过T细胞表面表达抗原提呈细胞（APC）共刺激分子传递[9]。这三个信号缺一不可，缺失任一个都将导致T细胞功能障碍。在这么多条共同刺激信号的传递中，起负向协同作用的PD-1的刺激分子和它的配体B7-H1被认为是与HCV感染时间持续时间有关[10]。我们前面提到了免疫细胞抑制性共刺激分子PD-1与它的配体（programmed death ligand-1，PD-L1）发生作用后会释放出抑制免疫的信号，降低T淋巴细胞反应，T细胞反应包括凋亡、抑制T细胞增殖和诱导细胞走向衰竭。Mcgary et al发现CHC患者外周血T细胞PD-1百分比明显增高[11]。Miller et al认为PD-1百分比增加是因为HCV核心蛋白与补体Clq R两者之间发生相互作用的结果[12]。

本研究发现，血清高病毒载量的CHC患者HCV RNA和Tfh细胞表面PD-1阳性率均显著高于低病毒载量组，而Tfh细胞百分比和血清IL-21水平均显著低于低病毒载量组，表明核心蛋白会影响T细胞活化、增殖等，导致其功能出现异常。PD-1与PD-L1的结合作用被阻断，导致PD-1功能无法发挥。在T细胞的信号传导过程中存在某种能抑制信号传导的病毒因素，如HCV核心蛋白的作用，使T淋巴细胞表面表达抗原分子受挫，功能被阻断，造成持续性的病毒感染。病毒为何能够长期在宿主器官中存在的原因可以从PD-1/PD-L1信号通路被阻断得到部分解释。

在一般情况下，机体外周血CD8+T淋巴细胞与CD4+T淋巴细胞占比是维持一种动态的平衡，维护机体免疫功能的基础[13]。在过去的研究中发现，CHC患者外周血CD8+T细胞占比降低，CD4+T细胞占比升高，CD4+T细胞/CD8+T细胞比值增高，CD19+B细胞也增高，T淋巴细胞亚群细胞表面PD-1表达增强，与健康人比较，差异均有统计学意义。CHC患者免疫功能发生了紊乱，T细胞动态平衡被打破，机体无法正常有效地清除HCV感染，进而出现慢性感染[14]。CD19+B细胞占比的增高可能是因为持续性的HCV抗原刺激，使B淋巴细胞不断的增殖，功能增强[15]。究其原因，可能是因为以下几点：①B淋巴细胞在HCV抗原的持续刺激下会不断地刺激免疫细胞产生IL-4、IL-6和IL-13等细胞因子，造成慢性感染；②T淋巴细胞功能被抑制，比如Th1细胞被激活，产生多余的转化生长因子β1（TGF-β1）；③慢性化可能会因为吞噬细胞、T淋巴细胞与NK细胞间相互作用而持续发生；④通过自身抗体的产生，发生免疫级联效应[16]。在患有B淋巴细胞缺陷的小鼠，无法产生自身抗体，而这种缺失会导致纤维化因子活性受到影响。本研究发现，高病毒载量组CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1阳性百分比显著低于低病毒载量组，提示慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群表面PD-1的表达水平会因为血清病毒载量的不同而不同。我们推测，在丙型肝炎病毒初次感染人体后，会避开机体的免疫防御机制使人体免疫力下降而不能清除病毒，这种影响包括降低CD8+T细胞的清除病毒能力，使CD4+T细胞的免疫调节功能受到抑制，促使细胞表面PD-1表达上调，结果就是不能及时有效地清除HCV感染，造成慢性丙型肝炎持续[17]。研究发现慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA水平、血清ALT水平、血清TBIL水平与外周血T淋巴细胞亚群表面PD-1表达存在相关性，但这种关联性不强，可能与影响因素过多有关。通过检测血清HCV RNA水平，可以判断HCV自我复制能力，并可通过血清ALT水平等，来综合判断CHC患者的肝损伤程度[18，19]。CHC患者免疫功能受损的多个方面与艾滋病患者免疫功能受损相似[20]，只是程度没有那么严重。检测外周血T淋巴细胞表面PD-1表达水平可以帮助评估患者免疫功能受损状态，再结合对病毒复制和肝脏受损程度的评估，就可以推测患者免疫功能受影响的方方面面。