冉燕翠，杨翠红，郑春燕，孙秀威

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科，哈尔滨1500810

胆囊癌是最常见的恶性胆道肿瘤，在世界范围内占恶性胆道肿瘤的80%～95%[1-2]，其发病隐匿，早期诊断率仅为19.1%，恶性程度高，预后差，总体5年生存率低于5%，中位生存期＜6个月[3]。目前手术治疗仍然是治愈原发性胆囊癌的唯一方法，但仅有20%～30%的患者能够获得根治性切除。研究表明，炎症与肿瘤之间关系密切，是诱发胆囊癌的重要因素[4]。90%的成人血清中可检测到EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）抗体，全球1%的恶性肿瘤与EBV有关[5]。本文就EBV与胆囊癌的关系作一综述。

1 EB V

1964年，Epstein和Barr通过电子显微镜在Burkitt淋巴瘤细胞中发现了第一种与人类肿瘤相关的病毒——EBV。EBV又称人类疱疹病毒4型，属于疱疹病毒科的γ亚科，形态与其他疱疹病毒相似，圆形，直径180 nm，基本结构含核样物、衣壳和囊膜三部分。核样物为直径45 nm的致密物，主要含长度约为172 kb的双链DNA，分子量为108。EBV通过唾液传播在成人人群中普遍存在，人群感染率高达90%，主要感染B淋巴细胞和上皮细胞，以潜伏期和裂解期两种形式存在于宿主细胞中[6]。EBV在宿主细胞中潜伏感染，干扰机体的免疫功能，刺激细胞增殖和转化并致癌。目前，已有研究证实EBV与传染性单核细胞增多症[7]、Burkitt淋巴瘤[8]、霍奇金淋巴瘤[9]、NK/T 细胞淋巴瘤[10]、鼻咽癌[11]、胃癌[12]、子宫颈癌[13]、甲状腺肿瘤[14]等的发生有关。

2 EBV的致癌机制

EBV基因组是一条长度约为172 kb的双链DNA，其通过EBV膜蛋白gp350与淋巴细胞受体CD21和人类白细胞抗原Ⅱ（human leukocyte antigenⅡ，HLAⅡ）相互作用进入B淋巴细胞。通过上皮细胞膜受体分子神经菌毛素1（neuropilin 1，NRP1）与病毒糖蛋白gB的C端（C-end rule，CendR）特殊结构域之间的相互作用，使得EBV以巨胞饮和脂筏依赖的内吞机制进入上皮细胞，实现对宿主细胞的感染，并激活NRP1依赖的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）-胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路。EBV还可直接与感染的B淋巴细胞接触进入上皮细胞。在原发感染时，EBV在上皮细胞或B淋巴细胞中复制，然后为了逃避免疫监视，关闭大部分基因并进入潜伏期，以静息记忆B淋巴细胞为主要宿主[6]。潜伏感染时EBV基因主要表达6种核抗原（Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA）（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和EBNALP）、3种潜伏膜 蛋 白（latent membrane protein，LMP）（LMP1、LMP2A和LMP2B）、2种EBV编码的小RNA（EBER1和EBER2）和2组微小RNA（microRNA，miRNA）（BHRF1、BART）。

2.1 EBNA 1

EBNA1是唯一一种在所有EBV相关恶性肿瘤中都表达的病毒蛋白[12]。EBNA1基因是EBV基因组复制和维持的关键，可能是致癌基因，可改变细胞环境并促使基因组不稳定。此外，EBNA1还可通过下调癌基因myc的表达，增强抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和存活蛋白（survivin）的表达，抑制细胞凋亡，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，导致染色体畸变[15]。

2.2 EBNA 2

EBNA2对促进转化的B淋巴细胞增殖和防止转化的B淋巴细胞凋亡具有重要意义，EBNA2还可与EBNA3C联合，激活LMP1启动子。已有研究证实EBNA2的表达与肿瘤发生有关[16]。

2.3 EBNA 3

EBNA3的作用是抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的积累，降低抑癌基因人视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）基因的表达，稳定癌基因c-myc的表达，并抑制促凋亡蛋白BIM的表达[17]。

2.4 LMP 1

LMP1是由BNLF1基因编码的一种跨膜病毒蛋白，是EBV的主要致癌蛋白，是将静止的原代B淋巴细胞转化为增殖性淋巴母细胞所必需的蛋白。LMP1是一种组成性激活的CD40受体，可激活参与记忆B淋巴细胞分化和抗凋亡蛋白表达的下游信号通路，这些下游信号通路包括核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK、磷脂酰肌醇3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、Notch和JAK激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）[18]。

2.5 LMP 2

LMP2是一种亲水性膜蛋白，由于起始转录的启动子不同而形成两种不同的表达产物LMP2A和LMP2B。研究表明，LMP2B能够促进上皮细胞的扩散，增强其能动性[19]。LMP2A能够通过抑制转化 生长 因 子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达，诱导细胞凋亡，激活NF-κB信号通路，上调survivin及细胞周期蛋白E（cyclin E）的表达，促进细胞进入S期，从而促进细胞增殖[20-22]。

2.6 miRNA

EBV编码的miRNA是一种非编码RNA，在EBV感染的细胞中大量表达，其在病毒感染、细胞凋亡、肿瘤侵袭与转移等过程中发挥重要的生物学功能。研究表明，促凋亡蛋白（如BIM）[23]、凋亡相关基因受体（如Bax受体TOM22）[23]、Bcl-2基因[24]、凋亡终末剪切酶胱天蛋白酶3（caspase 3）[25]是miRNA的直接靶点，可抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞生长。miRNA可通过抑制抑癌基因PTEN的表达和调控上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影响肿瘤的侵袭与转移[26-28]。此外，miRNA还通过激活白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信号转导及转录激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，下调细胞周期依赖性激酶抑制剂p21和p27的表达，促进耐药[29]。

3 EBV与胆囊癌

段建峰等[30]研究表明，35例胆囊癌患者中，EBV感染患者16例（45.7%）；35例胆囊良性疾病患者中，EBV感染患者3例（8.6%）。胆囊癌患者EBV感染的发生率高于胆囊良性疾病患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示胆囊癌与EBV感染有关，且胆囊癌和胆囊良性疾病患者EBV感染的发生率不同，为临床诊断及治疗提供了理论基础。

4 以EBV为靶点的治疗

在大部分EBV相关恶性肿瘤中，几乎所有的肿瘤细胞内都包含病毒基因组，同时，宿主体内其他部位存在的EBV阳性非肿瘤细胞数量非常少，使得以EBV基因组为靶点治疗EBV相关恶性肿瘤成为可能。目前抗EBV治疗的方法主要包括药物治疗、免疫治疗和病毒靶向治疗。

4.1 药物治疗

目前常用的抗疱疹病毒药物主要是嘌呤核苷类似物，如阿昔洛韦（acyclovir，ACV）、更昔洛韦（ganciclovir，GCV）和伐昔洛韦（famcyclovir，FCV），它们是抗病毒前体药物。EBV在肿瘤细胞中保持潜伏感染，这些肿瘤细胞对抗疱疹病毒前体药物不敏感。在丁酸等裂解期基因表达诱导剂的存在下，潜伏的EBV表达激酶，将前体药物转化为有活性的形式，如单磷酸化更昔洛韦（ganciclovir monophosphate，GCV-p），在病毒DNA复制时，三磷酸化更昔洛韦（ganciclovir triphosphate，GCV-TP）可以竞争性地结合到病毒DNA链上，使聚合酶链反应终止，细胞周期停滞，最终导致被EBV感染的细胞凋亡[31]。

4.2 免疫治疗

随着研究者对EBV相关恶性肿瘤发生机制的不断探索，免疫治疗成为EBV相关恶性肿瘤治疗的新方向。肿瘤免疫治疗包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗、免疫检查点抑制剂等。

4.2.1 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗是指用无致瘤性但有抗原性的瘤苗诱导患者产生特异性免疫反应的一种主动免疫，包括预防性疫苗和治疗性疫苗。1976年Epstein[32]首先提出采用疫苗预防EBV相关恶性肿瘤或降低其发病率。目前大多数研制预防性疫苗的工作都集中在EBV gp350上，因为EBV通过gp350与CD21结合感染细胞，同时gp350是EBV和被感染细胞中最丰富的糖蛋白，也是产生中和性抗体抵御病毒感染的首要靶标[33]。一项Ⅰ/Ⅱ期临床研究表明，应用病毒糖蛋白gp350重组体制作的EBV疫苗可诱导人类产生中和抗体[34]。Sokal等[35]研究表明，疫苗能够减少与EBV相关的疾病的发生，但不一定能预防感染。治疗性疫苗的作用是诱导细胞免疫。输注EBV特异性T淋巴细胞可延长霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌患者的生存期，这为治疗性疫苗的应用提供了证据。Smith等[36]应用EBV特异性自体T淋巴细胞治疗鼻咽癌转移患者，结果发现，接受细胞治疗患者的中位总生存期明显长于未接受细胞治疗的患者。另有一项研究纳入35例鼻咽癌患者，所有患者均接受化疗和EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（Epstein-Barr virus specific cytotoxic T lymphocyte，EBV-CTL）治疗，其有效率为71%，2年和3年生存率分别为63%和37%[37]。因此，一种能诱导机体产生EBV特异性T淋巴细胞的疫苗可能会提高EBV相关肿瘤患者的生存率。由此推测，EBV疫苗可能在EBV阳性胆囊癌患者的预防与治疗中具有重要作用。

4.2.2 过继性免疫治疗过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离出有活性的免疫细胞，在体外经筛选及扩增后诱导产生高度特异性的具有抗肿瘤活性的免疫细胞，再将其回输给患者，从而达到治疗肿瘤的目的。EBV相关恶性肿瘤中可表达EBNA、LMP、EBER等病毒蛋白，它们均可作为EBV-CTL治疗的靶抗原，且EBV-CTL的抗肿瘤效应已经得到证实[38]。假设部分胆囊癌与EBV的感染有关，应用EBV-CTL治疗胆囊癌理论上会取得一定的疗效。但目前国内外相关报道较为罕见，需经研究证实。

4.2.3 免疫检查点抑制剂免疫治疗是最近十年针对肿瘤治疗的重大突破之一。免疫治疗的目的在于发生免疫反应时，机体能保持自我耐受和防止组织受损。肿瘤细胞可利用免疫检查点的激活来逃避免疫监视。通过封锁免疫检查点，重建正常的抗肿瘤免疫系统是一种新型、有前景的治疗肿瘤的方法[39]。目前的研究中效果最显著的是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）、程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）及程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）免疫检查点，免疫检查点抑制剂能重新激活抗肿瘤免疫，促进肿瘤消退。许多临床试验结果表明，在实体肿瘤中利用免疫检查点抑制剂阻断CTLA4/PD-1/PD-L1信号通路可以获得良好的疗效和安全性[40-43]。目前CTLA4单克隆抗体伊匹单抗（ipilimumab）已被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤，PD-1抑制剂派姆单抗（pembrolizumab）和纳武单抗（nivolumab）已被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤和转移性肺鳞癌。研究表明，EBV感染的鼻咽癌患者肿瘤组织中CTLA4、PD-1及PD-L1的表达水平均明显高于非肿瘤组织，且与患者预后有关[44]。目前尚不清楚CTLA4、PD-1及PD-L1在EBV相关的胆囊癌中的表达情况，有待进行此方面的研究。

4.3 病毒靶向治疗

在大多数EBV相关恶性肿瘤中，绝大部分肿瘤细胞都含有病毒基因组，而在正常组织中EBV感染率极低，这种肿瘤特异性为研究治疗策略提供了理论依据。在EBV感染的裂解阶段，EBV感染的细胞中胸苷酸激酶可将前体药物GCV转化为有活性的细胞毒性形式。活性GCV可干扰病毒和宿主DNA聚合酶的合成，导致肿瘤细胞DNA复制的终止，诱导细胞凋亡，这使得EBV暴露于宿主免疫监测中，并且磷酸化的GCV可以转移到相邻的细胞中，从而诱导其他EBV阳性肿瘤细胞的凋亡[45]。因此，在EBV阳性的肿瘤细胞中，诱导EBV进入裂解周期可能成为治疗EBV相关肿瘤的一种新方法。目前，佛波酯（如TPA）、丁酸钠（sodium butyrate，SB）[46]、曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）[47]、5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）[48]是诱导EBV裂解基因表达的常用药物。TPA是蛋白激酶C的激动剂，可促进BZLF1和BRLF1基因转录因子的激活[49]，表观遗传抑制剂（如SB、TSA和5-aza）可以在BZLF1和BRLF1基因的启动子处打开染色质，TPA与表观遗传抑制剂联合使用可诱导EBV进入裂解周期。特定的抗肿瘤药物可诱导EBV裂解复制，并使肿瘤细胞对核苷类抗病毒药物敏感。亚色胺苯胺羟肟酸是一种组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂 ，可通过干扰BZLF1和BRLF1基因沉默促进EBV的重新激活，从而促进转录因子进入细胞核，而GCV增强了其在体外和荷瘤裸鼠体内杀死EBV阳性淋巴瘤细胞的能力[50-51]。部分凋亡诱导剂如吉西他滨、多柔比星、依托泊苷和淫羊藿苷，可诱导EBV的重新激活，吉西他滨和多柔比星可激活BZLF1和BRLF1基因启动子的转录。另外，PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路也参与了诱导EBV的裂解和复制。研究表明，依托泊苷可引起Akata细胞中EBV的重新激活[52]。另有研究表明，淫羊藿苷可通过抑制LMP1介导的AKT/STAT3信号通路，诱导EBV裂解基因的表达[53]。研究表明，利妥昔单抗和地塞米松联合作用于EBV阳性和CD20阳性的淋巴瘤细胞时，EBV早期抗原的表达量明显增加，可以诱导EBV从潜伏期进入裂解期，然后联合抗疱疹病毒药物（如GCV），可以达到较好的抗肿瘤效果[54]。Tikhmyanova等[55]在66 840个小分子化合物中发现了5种四氢咔唑衍生物，被称为C09、C50、C53、C60、C67，它们能够有效地激活各种类型细胞中潜在的EBV，这5种化合物与GCV联合应用显示了病毒靶向治疗的前景。Choi等[56]对50 240种小分子有机化合物进行了高通量筛选，以确定EBV阳性上皮恶性肿瘤中EBV裂解周期的最强诱导剂。因此，诱导EBV裂解药物联合抗疱疹病毒药物（如GCV）的应用已被认为是治疗EBV阳性肿瘤的一种新策略，这为EBV相关性胆囊癌的治疗提供了一个新的治疗思路。目前国内有关病毒靶向治疗与EBV相关性胆囊癌的研究尚不多见，需要大量研究证实。

5 小结与展望

EBV相关恶性肿瘤是世界范围内一个重要的健康问题，在东南亚和中国的发病率较高。胆囊癌是最常见的恶性胆道肿瘤，其恶性程度高，预后差。目前国内外有关EBV与胆囊癌关系的研究较少，只证实部分胆囊癌患者存在EBV感染，但EBV是独立的致癌因素，还是在其他高危致癌因素下促进肿瘤的发生，以及其具体的致癌机制尚待深入研究。免疫治疗及病毒靶向治疗在EBV相关恶性肿瘤的治疗中具有较好的前景，也许能为胆囊癌的治疗提供新的思路，从而提高患者的生存率，改善患者的生活质量。