邹洋洋,杨旻

临床上我们经常会遇到许多缺血性损伤疾病，如各种休克、器官移植、血栓形成或栓塞、心肺复苏等。在以前，传统的观点认为缺血性损伤疾病主要是供氧不足和能量传递障碍导致的细胞损伤为主，因此在治疗上提出因尽早恢复缺血组织的血液灌注。然而，在临床上我们发现即使恢复缺血组织灌注也不会减轻损伤的进展，相反，在部分个体或器官上会出现加重情况甚至出现远隔器官的功能障碍。1985年有学者就上述现象提出了缺血再灌注损伤概念，将缺血或缺氧的组织器官损伤后恢复循环灌注后导致缺血性损伤情况加重的现象称为缺血再灌注损伤。从缺血再灌注的提出到现在仍未完全清楚其产生的病理生理机制，它是一个由多种细胞和介质共同参与的复杂病理生理过程。就目前研究缺血再灌注损伤产生的机制途径来说其核心环节主要包括氧自由基的大量产生，微血管功能障碍，细胞内钙超载，过度炎症反应的激活，近年最新发现细胞凋亡可能在再灌注损伤中起重要作用，上述的相关损伤机制不是独立，它们之间可互相作用、互相激活、互相调节，其产生都依赖着一个上游载物“内皮细胞”[1]。自从内皮细胞被发现就有很多研究说明其与许多疾病有着密切的关联，有研究在缺血再灌注损伤方面内皮细胞的损伤同样重要。由于缺血再灌注损伤可涉及不同器官和组织甚至远隔的器官损伤，使得疾病进展的速度和程度难以判断，且缺少相应的指标来指导治疗和评估治疗效果。基于此，在临床上提出对内皮细胞损伤相关标志物的研究，可以定量或定性地反映内皮细胞损伤的程度，从而判断疾病的进展和预后，近一步为探讨相关治疗手段提供理论基础。

1 缺血再灌注与内皮细胞损伤

内皮细胞不仅存在于血管内壁上，且覆盖于心脏和淋巴管腔面上呈单层纵向分布。它的功能不只是起到屏障作用还对机体的各方面产生效应。如调节新生血管的形成参与发育、女性生理周期和创伤修复等生理反应；影响凝血纤溶过程，内皮细胞可合成和分泌相关凝血因子和纤溶物质在凝血与纤溶之间保持动态平衡，从而维持正常的血液流动循环；调节血管舒张和收缩，内皮细胞分泌的活性物质在调节血管特别是微循环血管的张力中发挥重要作用[2]。

1.1缺血再灌注致内皮损伤途径有研究表明缺血再灌注早期氧自由基的产生依赖于富含黄嘌呤脱氢酶的毛细血管内皮细胞损伤的释放，在缺血期由于组织及细胞缺血缺氧时ATP供给不足，一方面ATP分解产生大量的次黄嘌呤堆积在组织和细胞中，另一方面，使依赖ATP的Na+-Ca2+泵失活，Ca2+向细胞内流动增加激活Ca2+依赖的蛋白酶使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶。再灌注时大量血液中的氧进入缺血区域和内皮细胞中，被内皮细胞中堆积的黄嘌呤氧化酶催化生成氧自由基和羟自由基,当内皮细胞中氧自由基超过机体抗氧化能力时就会被释放到血液中导致全身的细胞膜结构损伤和功能障碍，最终造成恶性循环[3]。缺血过程中还伴有内源性抗氧化系统降低，如超氧化物歧化酶失活使机体抗氧化能力降低。有研究证明，在家猪心肺复苏后给予亚低温保护可以抑制氧自由基的产生，从而可以使内皮细胞分泌的一氧化氮(Nitric Oxide,NO)不至于过度氧化，减轻微血管的过度收缩[4]。

内皮细胞损伤后会导致机体产生级联反应，对组织和器官的损伤远远大于内皮细胞损伤本身带来的后果。越来越多的研究证明血管内皮细胞和白细胞的相互作用是缺血再灌注损伤重要机制，内皮细胞启动的损伤被继之而来的中性粒细胞浸润、激活[5]。内皮细胞与白细胞的作用主要依靠黏附分子来进行，不同阶段由不同的黏附分子按一定的排列介导。首先由选择素家族的黏附分子所介导的滚动阶段，最重要的包括E-选择素，L-选择素，P-选择素。在缺血阶段内皮细胞膜表面的P-选择素、L-选择素表达上调，数分钟后就会出现中性粒细胞的趋化滚动，在E-选择素的影响下中性粒细胞向损伤的内皮细胞旁滚动持续数小时，然后中性粒细胞上的β2-整合素与内皮细胞上的黏附分子互相结合，使中性粒细胞牢固黏附在内皮细胞上对其产生损伤：①牢固黏附的中性粒细胞使内皮细胞处于一个密闭的环境将其与血清隔开，血清中的一些抗蛋白酶和自由基清除剂就不能进入内皮细胞中和其中的有害物质从而使内皮细胞损伤；②此时募集的白细胞都为激活的白细胞，其中活化的单核/巨噬细胞可产生炎症因子如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),从而使内皮细胞损伤，相关机制不明。在对内皮细胞损伤机制的研究中表明给小鼠注射TNF-α后6 h，小鼠的小肠、肺、肾脏等组织均发生内皮细胞的坏死。另外在一组对脓毒症中血管内皮细胞损伤的研究中给予脓毒症大鼠重组人可溶性TNF受体1(rsTNFR1)后，血管内皮损伤明显减轻从而推断TNF-α可介导内皮细胞损伤[6]。

内皮细胞内钙含量的异常升高可在组织缺血后数分钟内体现出，且再灌注后短期内也可使大量钙进入细胞内并持续较长时间。现研究，钙超载对再灌注期内皮细胞损伤有着重要的作用。细胞缺血期间，能量代谢障碍导致ATP的缺乏，膜上的Na+泵失活使Na+内流增加，激活Na+-Ca2+交换蛋白通过继发性反向转运将Ca2+转运至细胞内。同时再灌注期，组织供氧和营养增加激活Na+-Ca2+泵可使缺血期导致的细胞内过高的Na+重新运至细胞外，从而使Ca2+内流增加。Bondarenko等[7]在临床实验中发现，给予N-花生四烯甘氨酸一种血管舒张性能脂氨基酸，可通过抑制Na+-Ca2+交换蛋白观察到胞内Ca2+超载减轻，再灌注内皮细胞损伤改善。再者，缺血再灌注时内源性儿茶酚胺释放激活磷脂酶C由此产生三磷酸肌醇(Inositol1,4,5-triphosphate,IP3)和二酰甘油(Diacylglycerol,DG)，IP3可促进细胞内肌质网的Ca2+释放，DG可通过激活蛋白激酶C调节上游的Na+-Ca2+泵，同样使胞内Ca2+浓度升高。钙超载可引起细胞内线粒体的损伤，但具体的机制仍不清楚。有研究认为可能胞内Ca2+超载，引起线粒体膜通透性转运孔不可逆过度开放。这样H+就可自如进入线粒体基质，使氧化呼吸链解偶联ATP合成停止，线粒体基质外流还原性谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终使基质渗透压增加线粒体损伤[8]。中国学者研究报道在鼠心肌缺血后，细胞内钙超载可导致线粒体呼吸链损伤，最终导致缺血区内皮细胞损伤[9]。由上所述缺血再灌注时可以通过钙超载-线粒体-氧化应激使内皮细胞功能障碍。

1.2内皮细胞损伤对机体影响上述已经提出内皮细胞和白细胞的密切关系。缺血再灌注损伤所造成的器官组织功能障碍其中最重要的机制为微血管损伤，其产生为血管内皮细胞和白细胞的相互激活所致。内皮细胞是构成微循环的重要组织学基础，缺血时内皮细胞本身释放的以内皮素为代表的缩血管因子，可致微血管收缩血流速度减缓形成微循环障碍。另外损伤的内皮细胞产生过量的超氧阴离子和再灌注后活化的白细胞产生的超氧化物可使内源性NO失活，从而使NO介导的微血管舒张功能减退，最终打破微血管舒缩平衡。在正常情况下，血管内皮细胞与血液中的各种物质有相互排斥作用，缺血再灌注时白细胞和内皮细胞牢固黏附然后贴附在富含内皮细胞的微血管表面。一方面，此时的白细胞变形性下降，在狭小毛细血管处出现白细胞的嵌顿造成微循环障碍。再者，中性粒细胞可以释放氧自由基、炎性介质等导致微血管堵塞，加重微循环障碍[10]。此外，白细胞活化可直接损伤微血管内皮的连接，造成其跨细胞通透性及旁细胞通透性增加使缺血组织水肿影响微循环。上述机制导致微循环障碍在再灌注后缺血组织会出现“无复流”现象，这就解释了缺血再灌注后机体组织缺血情况仍得不到缓解的症状。

自从20世纪80年代开始，内皮细胞活化在炎症中作用就广泛受到关注。内皮细胞易受白细胞和炎症因子的作用，反之它又可通过诱导蛋白及其它成分的合成、分泌影响炎症反应的进展。内皮细胞的损伤激活核转录因子调控的炎症相关基因的表达，快速增加细胞因子和化学趋化因子的合成与释放，这些细胞因子可以通过不同途径发挥炎症效应。一方面，它们能招募白细胞并使其活化，以促进受损组织甚至远隔器官的炎症反应，进而导致机体功能障碍。另一方面，它们通过向抗炎细胞拮抗，如分泌抗炎细胞因子的辅助性T细胞2(helper T cell,Th2)。一般炎症发生时Th2表达上调，但在缺血再灌注时Th2类细胞能量障碍导致对炎症因子的刺激不发生反应性增殖或分泌细胞因子，表现为免疫麻痹。此外这些炎症因子又可经过内皮细胞旁分泌和自分泌途径作用与白细胞，释放更多的炎症因子形成级联的“瀑布效应”导致失控性炎症反应。这就是为什么有很多学者在缺血再灌注相关疾病中发现类脓毒症综合征。Bro-Jeppesen等[11]发现在心脏停搏病人恢复自主循环后内皮细胞损伤继发血浆中炎症因子显著增加，有部分病人引发炎症级联反应形成全身炎症反应综合征最终导致多器官功能障碍综合征的发生。

1.3内皮细胞损伤相关药物治疗临床上已经注意以减少内皮细胞活化、损伤和促进其修复为目标的治疗药物。在些药物从保护内皮细胞方面改善全身炎症反应及微循环障碍等，在很多相关疾病中的治疗和转归上有重要影响。

乌司他丁是一种广谱蛋白酶抑制剂可减少炎症因子的合成，但其具体机体不明。有学者表明乌司他丁可抑制内皮细胞损伤时黏附分子的产生，减缓白细胞与内皮细胞的黏附，使血管微循环障碍得以改善。在脓毒症动物实验中发现乌司他丁干预组循环内皮细胞明显减少且内皮细胞活化特异标志物E-选择素水平较对照组降低，提示乌司他丁对内皮细胞损伤具有保护作用[12]。血管紧张素-2(Angiogenin,Ang-2)为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的主要活性蛋白，其可刺激过氧化产生及舒血管的内皮NO减少，从而导致内皮功能障碍[13]。抗AngⅡ药物经常被用于治疗冠状动脉硬化及高血压。最新发现此类药物都可以激活RAS的另一个成员血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme,ACE2)的产生,其可将AngⅡ催化为Ang-(1-7)。它与Mas受体结合形成ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴，此轴与AngⅡ生物学效应相拮抗可抑制AngⅡ诱导的内皮细胞损伤和氧化应激[14]。Zhang等[15]研究提出使用氯沙坦的药物组可阻断AngⅡ诱导的内皮细胞ACE2活性下调作用，抑制动脉粥样硬化的进展。近年来，他汀类降脂药物在对血管内皮保护方面研究也比较热门，其主要机制有人提出是上调NOS表达使iNO释放增多，且对内皮细胞损伤时内皮素-1的表达具有抑制作用[16]。也有学者认为他汀类药物可以减少高迁移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)的激活，因为HMGB1作为“损伤模式相关分子”诱导内源性炎症增加是内皮细胞的通透性遭到破坏。他汀类药物也可阻断由HMGB1/TLR4形成的经典内源性炎症途径，并且该途径涉及HMGB1介导的内皮细胞渗透性损伤，由此推测他汀类药物在缺血再灌注内皮细胞损伤中起重要的保护作用[17]。

2 内皮细胞损伤相关生物标志物

为探索损伤内皮细胞的因素及机制，以及研究受损内皮分泌的活性物质 变化在疾病中的作用及机制，近年来一些具有内皮细胞自身特异性的血清分子标志物被发现并已经逐渐在临床上应用，为早期发现内皮细胞损伤和可及时干预提供了可指导的指标。以下就近年来研究较热的内皮细胞损伤生物标志物做一概述。

2.1血管性血友病因子内皮细胞特异性分子储存器为weibel-palade小体，其储存的主要分子包括血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，内皮素-1等。这些物质均参与快速内皮细胞损伤释放，血清中上述成分的增加成为内皮细胞损伤的重要标记。vWF是血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成的一种糖蛋白，正常情况下存在于血浆和血小板(占全血15%)中。有研究表明在脓毒症导致急性肾损伤后，血浆中vWF的表达水平与肾组织内皮细胞的损伤程度直接相关，且其反映活体内皮细胞损伤的早期指标[18]。vWF可与血小板膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ结合，激活GPⅡb/Ⅲa并桥接血小板与vWF,从而促进血小板聚集。vWF还可以介导血小板粘附到内皮细胞损伤后暴露出的胶原表面，使血小板聚集，行成血小板血栓。有研究报道，通过检测血清vWF的水平，可以判断严重急性脑损伤的程度，结果提示局部脑损伤时vWF的浓度比弥漫性脑损伤时更高；有迟发性外伤性颅内血肿病人血清vWF浓度比没有者高；老年脑损伤病人血清vWF浓度比年轻病人更高[19]。

2.2细胞间黏附分子-1它是内皮细胞激活的另一个重要标志物，是介导细胞与细胞外基质之间相互接触和结合的一类物质。内皮细胞静息状态下细胞间黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)呈现阴性表达，而在炎症和感染时体内大量产生的炎症介质可引起ICAM-1表达异常增高，ICAM-1增高可促进中性粒细胞和血管内皮细胞的黏附，进一步引起内皮细胞的损伤。因此，ICAM-1的表达同血管内皮的损伤有互相关联。有研究表明这些黏附分子从胞膜脱落后形成的可溶性成分在血浆中含量增加可作为炎症和脓毒症病人血浆中含量均明显增加，且与全身炎症反应，器官损伤和病情转归有关[20]。此外最近热门研究用低温，药物等手段抑制ICAM-1表达，达到减轻炎症反应及减少内皮细胞损伤。目前所研究可以抑制ICAM-1表达调控途径有以下几种：①通过抑制内皮细胞核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化而减少ICAM-1基因的转录[21]；②抑制Janus激酶/信号转导和转录活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)磷酸化通路而减少ICAM-1基因的转录[22]；③在ICAM-1基因转录后通过促进ICAM-1 mRNA降解而减少ICAM-mRNA翻译成为蛋白质。最新有临床研究报道可使用杂环类抗抑郁药马普替林可显著降低脂多糖诱导ICAM-1表达，保护全身内皮细胞起到抗炎作用[23]。

2.3血管生成素-2Ang-2在循环血中含量增加是一个反映内皮细胞激活和功能障碍以及器官损伤程度的特异指标。酪氨酸激酶受体2(Tyrosine kinase receptors,Tie2)是目前已知的Ang-2的唯一共同体。内皮特异性Ang/Tie2配体-受体系统是内皮细胞激活的重要介质[24]。Ang-1与Tie2结合，使Tie-2的酪氨酸基团发生磷酸化，现阶段研究此可通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide3-(OH)/Protein kinase B,PI3K/PKB)，引发下游的内皮细胞保护信号释放[25]。也可维持血管内皮钙粘蛋白的结构和功能，降低NF-κB活性，减少黏附分子表达和抑制内皮细胞凋亡等途径，保护内皮细胞不受炎症的损伤减少渗出[26]；而诱导型Ang-2与Tie2结合拮抗Ang-1/Tie2，导致内皮细胞屏障功能的损伤。有实验研究在缺血缺氧诱导的肺损伤模型中给予外源性Ang-2会导致血浆循化内皮细胞增加，肺组织中性粒细胞浸润和血管通透性增加，Ang-2基因缺失则炎症损伤及血管渗漏就减少[27]。Fiedler等[28]学者指出Ang-2不仅可通过活化内皮细胞自分泌过程加重组织低灌注，还可增加内皮细胞对炎症因子TNF-α的敏感性。在无Ang-2存在时，当TNF-α浓度为40ng/L才能激活内皮细胞损伤，但当Ang-2明显高于正常值时，TNF-α浓度很低就可致内皮细胞受损并可促进白细胞趋化黏附内皮细胞过程加快。Ang-2在静息状态下血管组织几乎检测不到Ang-2 mRNA表达，但内皮细胞损伤激活后其表达明显上调。有研究表明从正常、无脓毒症的一般病人、脓毒症病人和脓毒症休克病人血中Ang-2含量依次升高，且血中Ang-2含量与病人的组织缺氧程度、动脉血氧分压、器官损伤程度及预后密切相关,此研究认为Ang-2水平比血管内皮生长因子更能反映脓毒症时血管内皮细胞损伤导致的肺血管渗漏[29]。因此，内皮细胞特异表达的Ang-2含量增加是危重病人死亡预后的独立指标。

2.4循环内皮细胞近年来对内皮细胞损伤研究较热门的标志物循环内皮细胞(Circulating endothelial cell,CEC)，顾名思义它是指外周血中测得的血管内皮细胞。正常生理情况下血液中含量极少，而在炎症、免疫应答、移植和心血管等疾病中可明显增加，是目前唯一可直接作为组织中反映内皮细胞受损的标志物[30]。最近几年由于流式细胞术在临床上的普及，使CEC的检测变得更加精确。Qamri等[31]研究中发现在肾移植病人中CEC的含量普遍升高且存在免疫排斥越强者CEC升高程度越明显，而且在肾穿刺切片中发现CEC与损伤的内皮细胞呈正相关。另外Fink等[32]在心肺复苏后缺血再灌注引起的复苏综合征中发现，使用特异性抗原CD146荧光标记的外周血CEC在心脏骤停病人恢复自主循环后显著增强，另外发生在恢复自主循环后CEC的增加和继发的内皮细胞损伤标志物vWF增加水平之间有强相关性，两者的结合对评估缺血再灌注后血管内皮细胞损伤严重程度是个很好的预测指标。

3 结论

内皮细胞的稳定性是正常生理功能的基础，其重要性被广大学者所认知。内皮细胞损伤是缺血再灌注损伤重要表现之一，同样内皮细胞损伤也可导致疾病的进一步加重。因此，临床上就急需某些可方便、快速、敏感的指标来准确的评价内皮细胞损伤的程度从而判断疾病的进展和预后。内皮细胞特异性标志物的产生和发展为此提供了很好的切入点，以后这些标志物对血管内皮细胞功能及其调节的探讨将会成为相关疾病研究的热点。