周炎，杨惠娟，史宏志，王景，张玉宁

河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化基地，河南郑州 450002

氮素对烟草的生长发育及其产量品质有着重要影响。硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中硝酸盐还原的限速酶和调节酶，与 NO3- 的积累关系密切，直接影响到植物氮肥的利用率，在植物氮代谢过程中具有重要作用[1-4]。烟草硝酸还原酶基因NIA（nitrate reductase [NADH]）分为NIA1和NIA2，分别来自普通烟草的父本和母本。研究发现，NR 积累量和活性会影响植株生长情况和硝酸盐含量，NIA基因的高表达也可增加种子蛋白质的积累量[5-7]，从而直接或间接地影响烟草的品质和安全性。

转录因子（Transcriptional Factors）是一类可与启动子结合并相互作用的蛋白，在基因的转录调控过程中起到了重要作用[8-9]，功能上可大体分为激活型和抑制型，可调控特定基因的表达。酵母单杂交系统是一种筛选DNA互作蛋白的有效方法，其突出特点是可在酵母细胞内研究真核细胞的DNA与蛋白质间相互作用，并通过筛选cDNA文库直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列[10-12]。酵母单杂交系统在转录因子的筛选上得到了较为广泛的应用[13]，在烟草中的应用多集中在抗逆性方面，有研究利用酵母单杂交技术在烟草中筛选出了与DRE顺式元件结合的抑制型DREBP类转录因子[14-15]。而针对NIA基因的互作蛋白研究尚不多见。筛选NIA启动子序列的互作蛋白可为其转录因子的研究奠定基础，从而更好地调控NIA的表达。

本实验重点在于NIA1启动子互作蛋白的筛选。通过克隆烟草硝酸还原酶基因NIA1的启动子，构建烟草cDNA基因表达文库，并进行酵母单杂交实验，旨在筛选NIA1启动子的互作蛋白，为硝酸还原酶基因的表达调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验体系采用 Clontech 公司的Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System。所用菌株为 Y1HGold，pAbAi 质粒用于构建诱饵载体，pGADT7-Rec AD 质粒用于 cDNA 文库筛选，均购自 Clontech 公司。所用试剂盒：Yeastmaker Yeast Transformation System 2、 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit；所用试剂：Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 / Mix 2、金担子素 A（aureo-basidin A，AbA）均购自 Clontech 公司；大肠杆菌质粒提取试剂盒购自 OMEGA 公司；DNA marker 购自 Biomed 公司；限制性内切酶购自 TaKaRa 公司；所用到的抗生素为氨苄西林（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）和金担子素 A（aureo-basidin A，AbA）。

实验用K326烟株为河南农业大学烟草栽培生理实验室培育，用于构建烟草cDNA文库。PCR产物测序在北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 NIA1上游启动子区域的克隆与诱饵序列的获得

在NCBI数据库中找到烟草氮代谢关键酶NIA1基因（Nicotiana tabacum nia-1 gene for nitrate reductase （EC 1.6.6.1），X14058.1），经过生物信息学分析，截取ATG上游938bp的碱基序列，设计引物，以烟草基因组为模板，通过PCR扩增技术获得片段，上游引物为NIA1-F：TATATATATGACCCTGCAATGAAAG；下游引物为NIA1-R：AGATTATTCTAAAAAAGAAAGAGAGAT。获得片段后进行测序，鉴定序列是否与目的片段一致，利用启动子在线分析网站plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析获得片段。

1.3 运用SMARTTM技术构建烟草K326品种cDNA文库

选取不同发育时期的K326植株，将根、茎、叶、花各组织以液氮速冻，提取各组织RNA进行混合，纯化总RNA后富集poly A+ mRNA，利用SMART技术和DSN酶，参照说明书构建烟草归一化cDNA表达文库。

1.4 诱饵载体的构建与诱饵报告菌株的获得

采用 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 提供的表达载体pAbAi，以XhoⅠ和HindⅢ分别双酶切NIA1启动子序列与表达载体pAbAi，酶切产物经纯化后，用T4连接酶连接并转化大肠杆菌，用含氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，提取质粒，经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后进行电泳鉴定。取酶切片段长度正确的重组质粒进行测序鉴定。

参照 Yeastmaker Yeast Transformation System2 说明书将诱饵载体转入Y1HGold菌株，转化液涂布于 SD/-Ura 固体培养基上，3d后挑取单克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 进行菌落PCR鉴定。

1.5 报告基因本底表达水平的测定

金担子素A（AbA）能高效抑制酵母细胞的生长，而 pAbAi 载体上含有 AbA 的抗性基因 AUR1-C。一旦有蛋白与 pBait-AbAi 上的诱饵序列结合便可使酵母产生 AbA 抗性，从而筛选出阳性菌落，确定目标文库质粒。进行文库筛选前必须先确定 AbA 最低抑制浓度即报告基因的本底表达水平，以排除酵母内源诱饵结合蛋白的干扰。

挑取 SD/-Ura培养皿上正常生长的诱饵菌株，将其悬浮于 0.9%的 NaCl 中，将 OD600值调至约0.002 后涂布在分别含 0、200、400至 1000 ng/mL AbA 的 SD/-Ura 固体培养基上，将完全抑制菌落生长的最低 AbA 浓度确定为文库筛选时使用的 AbA浓度。

1.6 酵母单杂交文库的构建和初步筛选

将纯化的双链 cDNA 和线性化的 pGADT7-Rec表达载体混合，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 的使用说明共转化诱饵酵母。将酵母细胞悬液分别稀释至1/10、1/100、1/1000 和 1/10000，各取100 μL 稀释液分别涂布在 SD/-leu 平板上，用于计算筛选的总克隆数。将剩余的约 15 mL 酵母细胞悬液按200 μL/皿涂布在对应浓度的 SD/-leu/AbA 平板上，进行阳性克隆的初步筛选。3～5 d 后统计 SD/-leu 平板上的克隆数，用于计算总克隆数，总克隆数须大于1.0×106。

总克隆数=cfu/涂板体积×稀释率×细胞悬液总体积。

1.7 阳性互作的鉴定

挑取 SD/-leu/AbA 平板上健康的单克隆，重新点在含AbA的SD/-leu培养基上，3～5天后挑取健康菌落重复这一骤。挑取最终在SD/-leu/AbA平板上生长的菌落，采用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 进行酵母菌落PCR，取少量产物进行电泳鉴定，将条带明亮的PCR产物送至公司测序，以T7为引物。数据返回后对序列进行生物信息学分析。选取有生物学意义的序列，采用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit提取与其编号对应菌落的质粒并保存。

2 结果与分析

2.1 NIA1基因启动子的克隆

根据选取的烟草NIA1基因上游序列设计引物 ,通过 PCR 进行扩增。将PCR产物进行电泳鉴定，其长度与目标长度相符（图1），测得结果表明目标序列已成功克隆（图2）。将序列在plantCARE网站上进行分析，结果表明，目标序列中含有多个典型的真核生物启动子顺式元件如CAAT-box、TATA-box 等，还存在多种响应元件如GA-motif、GARE-motif，符合启动子基本特征。

图1 NIA1基因启动子片段PCR克隆电泳图Fig.1 Electrophoretic diagram of cloned NIA1-promoter region

图2 NIA1基因启动子片段克隆测定序列Fig.2 Sequencing results of cloned NIA1-promoter fragment

2.2 诱饵报告菌株的转染与鉴定

将诱饵载体pAbAi-P:NIA1各自转入Y1HGold菌株，菌落PCR鉴定结果显示片段长度与理论值（1.35 kb+插入片段长度）相符，说明诱饵载体已成功转入酵母细胞（图3）。

2.3 诱饵报告菌株的AbA背景抑制浓度测定

实验结果表明（图4），NIA1诱饵菌株在400 ng/mL的AbA浓度下已无菌落生长。因此，最终文库筛选时NIA1诱饵菌株所用培养基的AbA浓度为400 ng/mL。

2.4 烟草K326 cDNA文库构建结果

烟草cDNA文库电泳鉴定结果（图5）中可以看出，条带呈弥散状且分布均匀，表明烟草全基因归一化表达文库构建成功，可以用于酵母单杂交实验筛选。

图3 阳性诱饵菌株的鉴定Fig.3 Identification of positive bait colony

图4 AbA最低抑制浓度的鉴定Fig.4 Identification of the minimum inhibitory concentration of AbA

图5 cDNA文库电泳图Fig.5 Electrophoretic diagram of cDNA library

2.5 酵母单杂交文库互作蛋白的初步筛选结果

酵母但杂交文库总克隆数为4.6×106（图6），满足要求。对阳性克隆进行菌落 PCR，结果表明（图7）插入片段长度分布在200 bp ～ 2000 bp之间，说明构建的文库容量和质量符合要求。

将上述PCR产物测序进行同源性比对，筛选出 9个有生物学意义的基因序列（表1），并分别对其进行电泳验证（图8）。

图6 文库筛选菌落生长情况Fig.6 Colony growth oflibrary screening

图7 NIA1启动子区域酵母单杂交筛库部分备选菌落的PCR结果Fig.7 PCR results of certain colonies in yeast one hybrid library of NIA1 promoter region

图8 NIA1启动子片段酵母单杂交文库筛选结果Fig.8 Screening results of NIA1 promoter fragment in yeast one hybrid library

表1 NIA1启动子序列转录因子筛选结果Tab.1 NIA1 promotor transcription factor screening results

3 讨论

本研究利用Clontech公司提供的酵母单杂交文库筛选系统构建了硝酸还原酶基因NIA1启动子区域的酵母单杂交文库，并筛选出 9 个来自烟草属的基因序列。其中，功能较为明确的蛋白有2个，分别是含有CRM（The chloroplast RNA splicing and ribosome maturation）结构域的CFM3蛋白（No.71）和亚硫酸盐氧化酶类似蛋白（No.126，Sulfite oxidase-like，SO）。其余蛋白功能尚不明确，但通过其结构域可对部分蛋白的功能进行推测。如No.51是未知线粒体类似蛋白、No.68含有胃蛋白酶类似结构域等。No.95是CMSS1转录变异体，含有p-环NTP酶结构域，其特点是具有Walker A和Walker B基序，可以分别与核苷酸的磷酸基团和Mg2+结合，目前研究已知P环NTP酶类在植物抗病方面发挥了重要作用[17]。

筛选得到的No.71（XP_016503563.1）蛋白与烟草中的预测蛋白CFM3有同源性，含有CRM结构域。已有研究发现，植物叶绿体中含有CRM结构域的蛋白能够与RNA结合，并参与对内含子的剪接[16]。RNA结合蛋白往往在基因表达的转录后调控中扮演重要角色，某些具有特殊结构的RNA结合蛋白也可作为转录因子与DNA结合[17]。有研究指出，CRM结构域也许能够在一定程度上特异地与催化性RNA互作[18]。目前已发现CFM3蛋白不仅作用于叶绿体group II内含子的剪接，也参与了线粒体基因的表达及其他一些植物和细菌的生命过程[19]。因此，烟草CFM3类似蛋白也有可能以某种形式参与了烟草NIA1启动子的转录调控。

No.126（NP_001312236.1）是普通烟草中的亚硫酸盐氧化酶类似蛋白SO。SO是如今发现的4种钼酶中分子量最小的一种，其 N 端含有钼辅因子（molybdenum cofactor，Moco）结构域，在高等植物种广泛分布且高度保守。有研究认为，植物的SO和NR有相当大的同源性，说明它们可能来自于一个共同的家族[20]。植物SO定位于植物过氧化物酶体，研究发现所有SO蛋白质的C端都含有一个过氧化酶体定位序列（peroxismal targeting sequence，PTS）[21-22]，试验表明，PTS 能够引导多肽进入植物、动物和酵母的过氧化物酶体中。但其对硝酸还原酶基因的转录表达调控的影响尚需进一步研究。