刘志飞 ，张志宏 ，邢力永 ，朱研峰 ，石 鹏 ，邓 刚

（1．天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211；2.唐山市人民医院泌尿外科，唐山063000）

膀胱癌为泌尿系统恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，随着社会发展，人们生活水平的提高，目前其发病率愈发升高，且明显呈现低龄化趋势，经尿道膀胱肿瘤电切术后非肌层浸润性膀胱癌患者在早期及时给予膀胱灌注吉西他滨药物已作为一种较好的辅助治疗方案，然而，目前对于如何监测非肌层浸润性膀胱癌患者对吉西他滨药物的敏感性尚待进一步解决。国外学者已经研究发现核糖核苷还原酶M1亚单位基因（RRM1）表达水平与膀胱癌患者生存时间有重要关系，通过检测RRM1的表达水平可以评估膀胱癌患者膀胱灌注化疗药物的敏感程度，对临床上选择辅助治疗方案具有重要指导意义[1]。本研究通过DNA基因液相芯片技术检测膀胱癌组织中RRM1的表达水平，分析RRM1与膀胱癌患者各项临床指标的相关性及与膀胱灌注吉西他滨药物疗效的敏感性，旨在为日后临床上膀胱癌患者术后行膀胱灌注治疗选择最佳化疗药物提供一定的指导依据[2]。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析唐山市人民医院自2013年1月-2017年3月的40例行经尿道膀胱肿瘤电切术的非肌层浸润性膀胱癌患者。患者年龄为31～78岁，中位年龄为（57.6±8.9）岁；男性患者 23例，女性患者17例；肿瘤最大直径0.8～3.5 cm，直径≥2 cm为16例，直径＜2 cm为24例；肿瘤单发为23例，肿瘤多发为17例。术后病理结果显示均为非肌层浸润性尿路上皮癌，其中高级别尿路上皮癌患者18例，低级别尿路上皮癌患者22例。术后所有患者均行吉西他滨药物膀胱灌注1年（吉西他滨注射液1 g与50 mL 0.9%NaCl注射液配组灌注，保留灌注时间1 h，初始为1次/周，共计8周，后改为1月/次，共计8月），术后随访膀胱灌注吉西他滨药物的膀胱癌患者复发情况，通过行泌尿系彩超、CT、膀胱镜检查诊断患者是否出现术后复发，随访1年期间膀胱癌复发患者6例（表1）。

表1 RRM1 mRNA的表达与膀胱癌临床病理特征的关系（例）Tab 1 Relationship between the expression of RRM1 mRNA and the clinicopathological features of bladder cancer(cases)

1.2 实验方法 取适量术后新鲜标本组织与裂解液混匀，温度设为65℃，1 400 r/min振荡孵育2 h。然后温度设为25℃，13 000 r/min离心5 min，取上层清液，作为样本检测。将上层清液转移至96孔板，加入支持探针-微球、支持延伸探针、缓冲液，温度调为54℃，750 r/min振荡14～18 h。次日将孵育板放在磁力架上1 min，弃去上层清液。加入洗涤液，震荡洗涤1 min，弃去上层清液；重复洗涤4次。加入扩增延伸探针和标记探针，温度设为45℃震荡反应1 h；弃去上层清液；用洗涤液洗3次；加入链霉亲和素-藻红蛋白，温度设为50℃震荡反应30min；用洗涤液洗2次；加入洗涤液，震荡5 min，于Luminex阅读仪上读取数据，分析实验数据（本实验检测出的物质为mRNA，本研究以mRNA体现蛋白表达水平）。

1.3 结果判定 通过读取Luminex IS2.3仪器显示结果，其中RRM1 mRNA在膀胱癌组织中检测表达率＜50%为低表达，≥50%为高表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0医学统计软件，描述分析40例膀胱癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤单发或多发、肿瘤组织分级、RRM1 mRNA的表达水平等临床病理特征的分布情况，对RRM1 mRNA的表达及其与非肌层浸润性膀胱癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤单发或多发、肿瘤组织分级等临床病理特征的关系及RRM1 mRNA的表达水平与吉西他滨药物敏感性的相关性采用χ2检验、Fisher确切概率法进行统计分析，将P＜0.05作为其间差异有统计学意义。

2 结果

40例非肌层浸润性膀胱癌患者中检测出RRM 1 mRNA高表达为16例，表达率为40%；RRM1mRNA低表达为24例，表达率为60%。RRM1 mRNA的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤单发或多发等参数无显著相关。

膀胱癌患者RRM1表达水平与膀胱癌分级的关系（表2），RRM1在高级别膀胱尿路上皮癌患者中呈现高表达为12例（30%），呈现低表达为6例（15%）；在低级别尿路上皮癌患者中高表达为4例（10%），低表达为18例（45%）。高级别尿路上皮癌与低级别尿路上皮癌患者中RRM1表达水平行χ2检验（1），所以 P＜0.05，因此高级别膀胱癌患者与低级别膀胱癌患者中RRM1表达水平差异有统计学意义，高级别尿路上皮癌患者中RRM1水平呈现高表达，低级别尿路上皮癌患者RRM1水平呈现低表达。

表2 RRM1在不同病理分级膀胱癌中的表达情况(例)Tab 2 Expression of RRM1 in bladder cancer with different pathological grades(cases)

膀胱癌患者RRM1的表达水平与膀胱灌注吉西他滨药物治疗效果敏感性关系（表3）：术后随访膀胱灌注吉西他滨药物的膀胱癌患者复发情况，其中RRM1低表达的患者复发1例（2.5%），RRM1高表达的患者复发5例（12.5%），RRM1高表达患者复发率是RRM1低表达患者的5倍，统计学分析χ2=6.3 ＞χ20.052（1），所以 P＜0.05，表明经吉西他滨药物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1高表达的尿路上皮癌患者复发率明显高于RRM1低表达的尿路上皮癌患者，所以吉西他滨药物在RRM1低表达膀胱癌患者中疗效优于RRM1高表达患者。

表3 RRM1与吉西他滨药物敏感性关系(例)Tab 3 Relationship between RRM1 and the sensitivity of gemcitabine drug(cases)

3 讨论

非肌层浸润膀胱癌患者行经尿道膀胱肿瘤电切术（TUR-BT）术后早期进行膀胱灌注敏感的化疗药物可以降低患者术后肿瘤的复发[3]，同时也有学者研究发现膀胱癌患者术后行膀胱内灌注化疗药物，术后复发率仍可达60%[4]。核糖核苷还原酶M1亚单位基因（RRM1）为DNA修复过程的限速酶[5]，定位于染色体11P15.5，这个染色体区域命名为L0H11A。Bergman研究表明RRM1基因是促使吉西他滨产生耐药的关键性靶点[6]。吉西他滨进入机体后，其吉西他滨RR的活性被吉西他滨磷酸化产物所竞争性抑制，导致dNTPs少量生成或不再生成，由于dNTPs是DNA合成所必需的底物[7]，所以抑制RR的活性便可以阻止DNA的合成从而诱导细胞凋亡，达到阻止肿瘤细胞增殖的目的[8]。有相关文献报道非小细胞肺癌患者在进行铂类及吉西他滨联合化疗时，mRNA表达水平较低的患者化疗后具有相对较长的生存期，表明RRM1基因是研究吉西他滨耐药的一个主要指标[9]。Reynolds等[10]研究发现，RRM1和ERCC1蛋白表达水平与化疗有效率之间具有显著的相关性，高表达者有效率低，二者在膀胱癌患者术后膀胱灌注化疗药物中有何作用仍需进一步研究，该研究结果将会在临床上为患者提供个体化治疗方案[11]。

本文结果表明RRM1的表达水平与膀胱癌肿瘤分级呈现正相关关系，经吉西他滨药物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1低表达的尿路上皮癌患者复发明显低于RRM1高表达的尿路上皮癌患者，由此表明嘧啶类药物在RRM1低表达膀胱癌患者中疗效优于RRM1高表达患者。高级别尿路上皮癌与低级别尿路上皮癌患者术后均可出现复发，笔者发现高级别尿路上皮癌患者中RRM1 mRNA高表达者对吉西他滨药物灌注疗效差，易出现复发，而低级别膀胱癌患者中RRM1 mRNA高表达者同样对吉西他滨药物灌注疗效差容易出现复发，这表明RRM1 mRNA表达水平与吉西他滨药物灌注疗效呈负相关关系。此结果与国内外多位学者研究相符。RRM1表达水平与患者预后有密切相关性，其表达状况直接影响化疗药物的选择，RRM1活性升高或表达水平升高均会导致化疗药物的耐药性产生。因此，非肌层浸润性膀胱癌患者行膀胱灌注治疗前通过检测RRM1基因表达水平，有助于判断吉西他滨药物敏感性，可以为患者选择最敏感的膀胱灌注药物提供一定指导依据，由于本研究数据有限，可能存在一定偏倚，尚需扩充研究对象数量以进一步探讨RRM1在膀胱灌注治疗选择合理药物中的重要性。