钱龙梁 ，曹福亮 ，2，汪贵斌 ，2

（1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

植物长期在生物和非生物的相互作用影响下会产生一些次生代谢物。次生代谢物是指植物中由次生代谢（Secondary metablism）产生的一类植物生长发育或者生命活动正常运行的非必需的小分子有机化合物。植物的次生代谢产物在植物的生命活动多个方面起着重要的作用，而且许多植物的次生代谢产物是其生长代谢所不可或缺的[1]。根据植物次生代谢物的性质和化学结构，一般将其分为3 大类:酚类（Phenolic）、含氮化合物（Nitrogen containing compound）和萜类（Terpene）[2]，而银杏叶片里富含大量的次生代谢物，如黄酮类、酚类、萜类内脂、类戊二烯类（甾醇和萜类）、喹啉类生物碱、p-植物外源凝集素等[3-4]，其中最具药用活性的成份是银杏黄酮类与萜类内酯类。黄酮类物质是一大类次生代谢物[5]，叶黄酮是次生代谢的结果,它的形成是以光合产物为基础。银杏叶片中含有重要的生理活性物质——类黄酮，它具有扩张血管、抑制血栓形成等疗效，且药负作用小，因此银杏叶制剂在国内外市场供不应求[6]。本研究通过研究不同接穗品种和气候对银杏嫁接苗中叶黄酮含量的影响，系统研究影响银杏嫁接苗叶中次生代谢物黄酮的合成因素。

1 试验地概况

3个试验地分别是广东省云浮市前锋镇菜坑村、四川省达州市开江县和云南省曲靖市沾益县。前锋镇位于云浮市城区南面，112°05′E，22°49′N，海拔754 m，前锋镇属南亚热带季风气候。累年平均气温21.3℃，降水量1 850 mm，霜日 7 d。开江县地域介于 107°42′～ 108°05′E、30°47′～ 31°15′N 之间，平均海拔 700 m，开江县境属于中亚热带湿润季风气候区，气候温和，热量充足，四季分明，雨量丰沛，季风气候明显，立体气候突出。开江县气候温润，雨量充沛，年均温16.6 ℃，年降水量1 259.2 mm，年日照1 386.6 h，无霜期长达282.6 d。云南省曲靖市沾益区沾益县位于 103°58′E，25°52′N，其海拔2 100 m，全年气候温和，降水充沛，干湿季分明，属低纬度高原季风气候。年平均气温16.3～18.6 ℃，极端最高温33.1 ℃，极端最低温-9.2 ℃，年日照时数2 098 h，日照率47%，全年无霜期255 d左右，年均降水量1 002 mm， 5—10月降水量占全年降水的89%。

2 材料与方法

2.1 试验设计

2017年3年18日，从江苏省邳州市陈楼镇银杏种质资源圃选取4个品种的接穗，分别是古银杏（叶丰）、泰兴大佛指、27#（南京林业大学一品种）、57#（大花穗），每个试验点都嫁接这4种接穗品种，同一个试验地的砧木都是相同品种的3年生实生苗，每个品种的接穗都采自同一树龄的银杏树上，3个试验点均由同一嫁接员采用劈接的嫁接方法进行嫁接，由于3个地距离较远，故嫁接时间前后相差1～2 d，且同一品种的接穗长短、粗细基本一致，接穗长15 cm，直径为5 mm，所有接穗均是双芽。由于接穗数量有限，故在广东嫁接古银杏60株、泰兴大佛指90株、27#和57#各120株；在云南嫁接古银杏30株、泰兴大佛指60株、27#和57#各120株；在四川嫁接古银杏30株、泰兴大佛指60株、27#和57#各120株。每个试验点的每个品种均有3个重复，采用随机区组实验设计，嫁接后3个地方的水肥管理均按照嫁接员提供的统一标准进行实施。

2.2 样品采集

2017年5年份分别去统计3个地方的嫁接存活率，8月和9月初分别在与砧木接合点上方 10 cm处有效芽抽出来的接穗一级分枝的上、中、下3个部位采取3～5叶，所有叶样均采用干冰保存带回后放入-193 ℃的超低温冰箱保存，用于后期测黄酮。

2.3 黄酮含量测定及方法

采用索氏提取和高效液相色谱[7-9]，测定法：分别精密吸取对照样品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：

本样品按干燥品计算，含总黄酮苷不得少于0.40%。色谱柱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）为流动相；检测波长为360 nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2 500。

2.4 数据处理与分析

采用Excel 2007进行数据统计分析，用SPSS 19.0软件中的Duncan 法对差异显著指标进行方差分析[10]。

3 结果与分析

3.1 接穗品种、试验地对银杏嫁接苗叶片中槲皮素含量的影响

不同接穗品种嫁接在同一个地方对银杏中槲皮素含量的影响表现出显著性差异。8月份4种接穗在广东、云南、四川嫁接后均表现出显著性差异，且均是古银杏这个品种的叶片中槲皮素含量最高，分别为0.622、0.672、0.488 mg/g；在云南、四川两地均是27#银杏叶片中槲皮素含量最低，分别为0.474、0.282 mg/g，而在广东则是57#槲皮素含量最低，含量为0.405 mg/g。9月份4种接穗品种在广东、云南嫁接后均表现显著性差异，且含量最高的均是古银杏，分别为0.521、0.876 mg/g，含量最低的均是57#，含量分别为0.306、0.451 mg/g。但在四川，古银杏、泰兴大佛指均与27#、57#两者呈显著差异，而27#与57#两者之间未出现呈显著差异。在广东地区槲皮素含量最高的是泰兴大佛指，为0.632 mg/g，含量最低的是27#，为0.415 mg/g。

表1 不同品种嫁接在同一地方对银杏叶中槲皮素含量的影响†Table 1 Effects of different varieties grafted in the same tested site on quercetin contents of G.biloba leaves

3.2 接穗品种、试验地对银杏嫁接苗叶片中山奈酚素含量的影响

不同接穗品种嫁接在同一个地方对银杏中山奈酚素含量的影响表现出显著性差异。8月份4种接穗在广东、四川嫁接后均表现出显著性差异，且均是古银杏这个品种的叶片中山奈酚素含量最高，分别为0.596和0.574 mg/g，在广东含量最低是57#，而在四川含量最低是27#，含量分别为0.326和0.224 mg/g；在云南则表现为古银杏和27#分别与泰兴大佛指、57#均呈现显著性差异，而泰兴大佛指与57#两者之间却未出现显著性差异，其中含量最高的是古银杏，含量最低的是27#，分别为0.777和0.401 mg/g。9月份接穗品种在广东、云南、四川嫁接后均表现显著性差异，且在广东、云南含量最高的均是古银杏，分别为0.520、0.999 mg/g，在四川含量最高的是泰兴大佛指，为0.572 mg/g，在广东、云南和四川含量最低的均是57#，含量分别为 0.301、0.422、0.330 mg/g。

表2 不同品种嫁接在同一地方对银杏叶中山奈酚素含量的影响Table 2 Effects of different varieties grafted in the same tested site on naikanapolil contents of G.biloba leaves

3.3 接穗品种、试验地对银杏嫁接苗叶片中异鼠李素含量的影响

不同接穗品种嫁接在同一个地方对银杏中异鼠李素含量的影响表现出显著性差异。8月份在广东，古银杏、泰兴大佛指均与27#、57#均呈现显著性差异，后两个品种间未出现显著差异，4个接穗品种中异鼠李素含量最高的是泰兴大佛指，含量最低的是古银杏，含量分别为0.159和0.092 mg/g；在云南，古银杏、27#分别与泰兴大佛指、57#呈现显著性差异，4个接穗品种中异鼠李素含量最高的是泰兴大佛指，含量最低是古银杏，含量分别为0.167和0.082 mg/g；在四川，则表现为古银杏分别与泰兴大佛指、27#、57#呈现显著性差异，而后3个品种之间却未出现显著性差异，其中含量最高的是泰兴大佛指，含量最低的是古银杏，分别为0.093和0.056 mg/g。9月份4种接穗品种在广东嫁接后表现古银杏、57#分别与泰兴大佛指、27#呈现显著性差异，而后两者之间未出现显著差异，4个品种中异鼠李素含量最高的是27#，含量最低的是古银杏，含量分别为0.129和0.080 mg/g；在云南，泰兴大佛指、27#分别与古银杏、57#呈现显著性差异，后两个品种之间却未出现显著差异，其中含量最高的是泰兴大佛指，最低的是古银杏，含量分别为0.158、0.112 mg/g，在四川，古银杏、泰兴大佛指分别与27#、57#呈现显著性差异，而后两者间未出现显著性差异，异鼠李素含量最高的是泰兴大佛指，最低的是古银杏，含量分别为0.144、0.071 mg/g。

表3 不同品种嫁接在同一地方对银杏叶中异鼠李素含量的影响Table 3 Effects of different varieties grafted in the same tested site on isorhamnetin contents of G.biloba leaves

3.4 接穗品种、试验地对银杏嫁接苗叶片中总黄酮含量的影响

不同接穗品种嫁接在同一个地方对银杏中山总黄酮含量的影响表现出显著性差异。8月份4种接穗在云南、四川嫁接后均表现出显著性差异，且均是古银杏这个品种的叶片中总黄酮含量最高，分别为3.827和2.794 mg/g，含量最低的均是27#，分别为2.552和1.501 mg/g；在广东则表现为古银杏和泰兴大佛指分别与27#、57#均呈现显著性差异，而27#与57#两者之间却未出现显著性差异，其中含量最高的是古银杏，含量最低的是57#，分别为3.310和2.200 mg/g。9月份4种接穗品种在云南嫁接后均表现显著性差异，而在广东则表现为古银杏和57#分别与泰兴大佛指、27#均呈现显著性差异，而27#与泰兴大佛指两者之间却未出现显著性差异，在四川表现为古银杏和泰兴大佛指分别与27#、57#均呈现显著性差异，而27#与57#两者之间却未出现显著性差异，广东和云南两个地方含量最高的均是古银杏，分别为2.862、5.021，含量最低的均是57#，分别为1.812、2.505 mg/g，在四川含量最高的是泰兴大佛指，为3.406 mg/g，含量最低的均是57#，含量分别为2.167 mg/g。

表4 不同品种嫁接在同一地方对银杏叶中总黄酮含量的影响Table 4 Effects of different varieties grafted in the same tested site on flavonoids contents of G.biloba leaves

4 结论与讨论

植物的次生代谢受到很多因素的影响，自身的品种对其次生的代谢物含量的影响最为显著，其次气候也是重要影响因素，次生代谢物种类繁多，而银杏叶中的次生代谢物主要以黄酮为主。因此，黄酮含量的多少可以作为判断银杏叶用价值的高低的标准之一，所以选择具有良好亲和性的砧穗以及合适的种植地是提高嫁接银杏叶中黄酮含量的关键因素之一[11-13]。本研究中，不同品种的银杏叶中总黄酮及各组分含量有一定的差异[14]，相同品种接穗在不同地方嫁接后，银杏叶片中总黄酮及黄酮各组分差异较大；相同地方不同品种接穗间差异也很大，黄酮含量的多少在一定程度上能反映该地区的环境条件的好坏，因为黄酮的合成与PAL 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase）[15-16]有一定的联系，而环境因素又会直接影响该酶的活性，PAL酶活性的降低导致类黄酮合成速率的下降[17]。总体上来说，一定范围内，含有充足水分的试验地有利于总黄酮的积累，云南属于高原，四季气候适宜，温度起伏不大，且雨水适宜，因此该地区的银杏叶片中黄酮含量要明显高于广东和四川，而温度变化过大以及雨水过多或过少均不利于黄酮各组分的累积，这与前人研究的适当干旱胁迫能促进叶内黄酮含量增加几乎一致[18]。因此，合适的接穗品种嫁接在合适的地方对银杏叶片中次生代谢物的合成十分重要。

本研究仅从黄酮含量方面研究了品种和气候对嫁接银杏叶次生代谢的影响，由于银杏叶中次生代谢物不仅仅于此，萜内酯的含量也是增加叶用银杏价值的重要指标，因此品种和气候对嫁接银杏叶中萜内酯含量的影响有待进一步深入研究。