张一凡, 柳雨汐, 陈香君, 白 雪, 高育哲, 单秀峰, 肖志刚

(沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034)

0 引 言

小米,学名粟,俗称谷子,即粟的脱壳产品,古时称禾、稷、粱、谷、稗等,为禾本科狗尾草草本植物。小米的栽培具有悠久的历史,原产于中国黄河流域,是我国的主要粮食,产量高达全世界的80%[1]。小米粒小,直径仅为1 mm,卵圆形,品种繁多。按颜色可分为白、红、黄、黑、橙、紫小米等,按成熟迟早可分早、中、晚,按籽粒黏性可分为糯粟和梗粟。小米营养丰富,含有人体所必需的营养物质,同时还具有一定的药用价值。

小米中蛋白质和碳水化合物含量很丰富,纤维素含量也高于其他作物,含有人体所必需的营养物质,同时还具有一定的药用价值[2]维生素是人生命活动必不可少的营养素,大多数维生素不能在体内合成,故多食用维生素含量高的食物是保证营养全面的途径。小米中VB1的含量较高,VA,VD,VC和VB12含量较低;一般粮食中不含有胡萝卜素或含量较少,而100 g小米中胡萝卜素含量0.12 mg。VB1具有保持循环、消化、神经和运动系统正常功能,调整胃肠道蠕动,参与糖代谢的作用,VB1缺乏常导致神经、消化系统、心脏的炎症和功能衰退,且易患脚气病;适量食用小米可以有效调节人体生理机能和生命代谢,补充人体不可缺少的营养物质。对于水溶性维生素的检测技术可以分为两类:微生物分析法和化学分析法,其中化学分析法主要包括分光光度计法、漫反射FI-TR法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、液-质联用法。目前,高效液相色谱法具有高压、高效、高灵敏度、分析速度快等优点,广泛用于维生素的确定[3-11]。采用高效液相色谱法检测VB1多以荧光检测器为主。由于小米中的VB1含量较高,通过响应面优化提取条件,优化色谱条件,建立应用紫外检测器测定谷物中VB1的合适方法。另外,针对不同产地维生素的比较目前研究也不够深入,本课题在优化的条件下,建立应用紫外检测器测定VB1的方法,并测定不同产地小米中的VB1的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料:样品小米(各地采集)。

试剂:甲醇(色谱纯):上海金穗生物科技有限公司;磷酸二氢钾(分析纯):沈阳化学试剂厂;磷酸(分析纯):沈阳化学试剂厂;冰醋酸(分析纯):沈阳化学试剂厂;盐酸(分析纯):沈阳化学试剂厂。

1.2 仪器设备

多功能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;DHG-9146A电热恒温鼓风干燥机,上海精宏实验设备有限公司;AL204电子天平,上海精科实业有限公司; PHS-3C酸度计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;GL-21M高速离心机,上海精密仪器研究所; SB-25-12DT超声波提取机,宁波新芝生物科技股份有限公司; AgiLent 1200LC高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司; UV-1200S紫外分光光度计,上海翱艺仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

将不同产地的小米样品分类编号,然后将小米样品用多功能粉碎机研磨成粉末,过80目筛,分装备用。

粉碎过筛后的小米加水溶解→超声波提取→离心后取上清液→过滤→HPLC检测。

1.3.2 单因素试验

准确称量1.0 g小米样品,在其他因素相同情况下分别考察溶剂浓度(水、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mol/L盐酸)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)、超声时间(0、15、30、45和60 min)、超声温度(20、30、40、50和60 ℃)对提取VB1的影响。

1.3.3 响应面法优化提取工艺

根据超声波提取小米中VB1的单因素试验结果,把吸光度值作为响应值,使用中心组合设计原理进行响应面分析。应用软件进行试验的设计,数据的处理以及优化,选取最优方案,试验因素水平表见表1。

表1 试验因素水平表Table 1 Test factor level

1.3.4 高效液相法测定条件

采用C18色谱柱,流动相:甲醇-0.2%磷酸水溶液=20∶80,流速:0.3 mL/min,检测波长246 nm,柱温:30 ℃,进样量:20 μL。

1.3.5 标准曲线的绘制

准确称量20 mgVB1标准品,加二级水定容到100 mL棕色容量瓶中,作为标准储备液(0.2 mg/mL),将标准品储备液稀释成0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μg/mL的工作液,按照1.3.4的色谱条件和方法依次进行测定,记录对应的峰面积,以峰面积为y轴,标准品浓度为x轴建立标准曲线,得出VB1的线性方程。

1.3.6 小米VB1含量测定

取1 g粉碎过筛后的小米样品溶解在11 mL二级水中,利用响应面优化的条件提取,然后在4 000 r/min的转速下离心10 min,取上清液经滤头过滤后,按照1.3.4的色谱条件和方法进行测定,记录峰面积。

2 结果与分析

2.1 单因素实验与分析结果

注: 1. 水; 2. 0.001 mol/l盐酸; 3. 0.002 5 mol/l盐酸; 4. 0.005 mol/l盐酸; 5. 0.007 5 mol/l盐酸; 6. 0.01 mol/l盐酸; 7. 0.025 mol/l盐酸; 8. 0.05 mol/l盐酸; 9. 0.075 mol/l盐酸; 10. 0.1 mol/l盐酸图1 溶剂浓度对提取VB1的影响Fig.1 Effect of solvent concentration on extraction of VB1

2.1.1 溶剂浓度对提取率影响

结果如图1所示。

由图1可知,水为提取溶剂时,提取液的吸光度最高,所以选取水为最终提取溶剂。

2.1.2 料液比对提取率影响

结果如图2所示。

由图2可知,料液比在1∶10时吸光度最大,随着溶剂量的增加,吸光度逐渐减小,在1∶20时迅速下降,其原因可能是达到最大提取量后,溶剂的增加稀释了溶液的浓度,从而导致吸光度下降,最终确定最佳料液比为1∶10。

2.1.3 超声时间对提取率影响

结果如图3所示。

图2 料液比对超声提取VB1的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on ultrasonic extraction of VB1

图3 超声时间对提取VB1的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on extraction of VB1

图4 超声温度对提取VB1的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction of VB1

由图3可知,随着超声时间的增加,提取液的吸光度逐渐增大,15 min时迅速增加,随后开始缓慢增加,45 min、60 min时吸光度增加的并不显著,在吸光度高的前提下考虑到尽量缩短试验时间,选择45 min为最佳提取时间。

2.1.4 超声温度对提取率影响

结果如图4所示。

由图4可知,随着温度的升高,提取液吸光度显著增加,40 ℃达到顶峰,随后缓慢下降,故选取40 ℃为最佳超声温度。

2.2 响应面法优化实验

2.2.1 Box-Behnken试验设计

利用超声波法提取小米中VB1的单因素试验结果,最佳料液比是1∶10、最佳超声时间是45 min、最佳超声温度是40 ℃。应用Box-Behnken中心组合设计原理优化工艺参数,进行响应面分析,分别选取料液比1∶5、1∶10、1∶15,超声时间30 min、45 min、60 min,超声温度30 ℃、40 ℃、50 ℃作为每个变量的低中高三水平,共设计17组试验,其中12个为分析试验,5个为中心试验,以估计误差。具体试验内容见表2。

表2 Box-Behnken设计与结果Table 2 Box-Behnken Design and Results

2.2.2 回归模型方差分析

应用Box-Behnken进行多元回归拟合分析,可得到提取液吸光度(Y)与各单因素A(料液比)、B(超声时间)、C(超声温度)之间的二次多项式模型式。

利用此二次回归方程可以为优化超声波法提取小米中VB1含量提供较好的数学模型,可对提取液吸光度的变化进行预测。回归模型的方差分析及显著性检验可知回归模型具有高度的显著性(P<0.000 1),决定系数R2=0.984 7,校正决定系数R2Adj=0.965 1,失拟项P=0.332 9>0.05,不显著,说明该回归模型与实验数据拟合程度较高,可以用该模型分析和预测超声波法提取小米中VB1的工艺结果。由F值可知,3个因素对提取液吸光度的影响大小依次为料液比(A)>超声温度(C)>超声时间(B)。且由P值可知,回归模型中的一次项均显著,其中料液比(A)、超声温度(C)均为极显著;二次项均为极显著,交互项AB和AC显著。

2.2.3 响应面交互作用分析

响应面图分析的图形是试验特定的响应值对应自变量构成的一个三维空间图,可以直观的反映各个自变量对响应值的影响,等高线的形状可以反映出交互效应的强弱。料液比、超声温度和超声时间3种因素之间的交互作用对提取液的吸光度影响显著。

采用Design-Expert 8.0.6.1分析得到的回归方程求解,得出料液比1∶11,超声时间47 min,超声温度43 ℃,此时提取液的吸光度最高。为验证此方案的真实性,在此添加量条件下进行3次验证试验。

2.2.4 验证试验

根据响应面软件得到料液比1∶11,超声时间47 min,超声温度43 ℃为最佳提取条件,提取液吸光度0.571。故验证试验结果在料液比1∶11,超声时间47 min,超声温度43 ℃时,进行3次重复性试验,试验结果分别为0.574、0.582、0.569。平均值为0.575,与理论值相差0.7%,拟合度较好,对试验有较好的指导意义。

2.3 检测条件的确定

用紫外分光光度计对配制好的的VB1标准品在190～400 nm下进行全波长扫描,结果在246 nm处VB1存在最大吸收峰,故选用246 nm为检测波长。在选定的波长下,测得标准品出峰时间6.962 min。按照上述检测方法测定小米样品,样品中VB1的出峰时间为7.036 min。根据出峰时间定性,峰面积定量,从而计算出样品中VB1的含量。

3 结 论

经过料液比、超声时间、超声温度单因素实验结果,得出最佳提取工艺为:料液比1∶11,超声时间47 min,超声温度43 ℃,结果表明3种因素对小米中VB1的提取均有显著影响,3个因素对提取液吸光度的影响大小依次为料液比(A)>超声温度(C)>超声时间(B)。另外,通过试验确定最终色谱条件:流动相为0.2%磷酸水溶液∶甲醇=80∶20,流速0.3 mL/min,检测波长为246 nm,柱温为30 ℃。VB1标准曲线为Y=64.769X+1.404 7,相关系数R2为0.999 3,在0.05 μg/mL～1.2 μg/mL质量浓度范围内具有良好线性关系。按上述色谱条件和方法测定小米样品中VB1的含量,样品平行配制3份,测得含量为0.536 mg/100 g。该方法简便、快速,对应用紫外检测器测定谷物中VB1具有一定参考价值,可为VB1的深度开发提供理论依据。