杨安康 谌晶晶 罗强 张健 杨媚 黄从新

近年来利用转录调控因子构建生物起搏,使细胞重编程为起搏样细胞,以模拟起搏细胞表型和功能,具有不同于以往单独转染离子通道的优势。众多转录调控因子,如Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1、Nkx2.5[1]从多方面参与胚胎心脏发育分化,并构成了复杂的网络系统,微妙调节心肌分化方向。不同于Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1等转录因子主要调控起搏样细胞发育分化,Nkx2.5主要调控工作心肌细胞发育分化,促进相关离子通道和缝隙连接蛋白的表达。

2017年,Protze等[2]研究人员通过对发育信号通路的阶段性调控,使人多功能干细胞产生了类窦房结样的起搏细胞,该起搏样细胞缺失Nkx2.5而表达了起搏标志物,调节胚胎心脏起搏细胞发育的众多转录因子如Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1表达水平升高,并可产生起搏电流,甚至移植至房室传导阻滞模型大鼠心尖部位,可有效起搏周围的组织。笔者利用RNA干扰技术,将携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列短发夹RNA(sh RNA)的腺病毒(Ad)转染体外培养的乳鼠心肌细胞(NRVMs),构建NRVMs的Nkx2.5低表达模型,以观察下调Nkx2.5表达对乳鼠心肌细胞的影响,来探讨该干预是否可以使心肌细胞重编程为起搏样细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物:1～3天的新生SD乳鼠,雄性,由湖北省疾病预防控制中心提供,动物许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)、胰酶(碧云天公司),Ⅱ型胶原酶、5－溴脱氧尿嘧啶核苷,携带shRNA和绿色荧光蛋白(GFP)质粒的腺病毒(深圳百恩维),大鼠超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)单克隆抗体(美国Abcam公司),HRP标记的二抗(KPL公司),Trizol试剂(InvitrogenTM),倒置显微镜、荧光显微镜(Leica公司),电泳仪、电泳槽(北京市六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 NRVMs的分离培养 常规方法分离培养NRVMs[3],将出生1～3天的新生SD乳鼠严格无菌操作取出心脏,使用预冷的PBS漂洗3次。将心脏剪成约1mm3的组织块,加入8～10 ml的0.125%的胰酶,于37℃恒温水浴锅中震荡消化10 min,弃上清。再加入4～5 ml含胰酶和Ⅱ型胶原酶的混合酶,消化5 min,留取上清加入同等量的完全培养基终止,重复上述步骤6～8次。将所得的心肌细胞悬液离心弃上清,经70μm的分子筛过滤,接种于10 cm培养皿中差速贴壁90 min。收集上清,接种于6孔板内,用于后续实验步骤。

1.2.2 鉴定心肌细胞纯度 采用免疫荧光法鉴定,将培养的NRVMs接种于放置爬片的培养皿中,48 h后用PBS轻柔清洗3遍,室温下用4%的多聚甲醛固定15 min,0.25%Triton-X100透化10min,驴血清封闭30 min后加入1∶100稀释的一抗α-肌动蛋白(α-actin)放于湿盒内4℃孵育过夜,再加入FITC标记的二抗避光室温孵育50 min后用DAPI 50～100 ul染色5 min,滴加适量的抗荧光淬灭剂于细胞中,盖玻片封片,于倒置荧光显微镜下观察并计数NRVMs。α-actin免疫荧光染色后,显示绿色荧光的细胞为NRVMs,无绿色荧光的细胞表示心肌成纤维细胞或其他细胞。

1.2.3 Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP的构建及扩增 设计并构建靶向Nkx2.5基因的sh RNA,将合成sh RNA克隆进入腺病毒载体Ad-U6-CMV-GFP,得到重组腺病毒质粒。将带有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒转化大肠杆菌菌株DH5a感受态菌株,将转化后的平板挑菌,提取质粒后酶切鉴定,用293A细胞进行扩增,待空斑形成后收集病毒并进行体外纯化和浓缩,直至获得大量纯化的Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP。

1.2.4 Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP的转染 确定最适感染复数(即MOI值),将NRVMs种于12孔板内,根据MOI值0,2,5,10,20,50分别加入Ad-GFP和Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP,以不含血清的F12培养基定容至0.5 ml,置培养箱中培养,4 h后将病毒悬液吸出,再加入1 ml不加双抗完全培养基,24、48 h后荧光显微镜下观察,以不引起明显细胞病变效应且最大转染效率的最大MOI值为合适的感染复数。所需病毒液的体积＝细胞数×MOI/病毒滴度,经过比较,确定本实验的最适MOI。

本实验将原代培养的NRVMs细胞随机分为阴性对照组(NC组)和实验组。实验组转染Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP,NC组转染等量的Ad-GFP,将原代培养的NRVMs于六孔板培养48 h后,弃原培养基,PBS轻柔洗3遍,先加入F12无血清培养基定容至1 ml,按最适MOI计算的所需腺病毒量,然后轻柔混匀,置于培养箱中培养,4 h后将病毒悬液吸出,再加入2 ml不含双抗的完全培养基,48 h后荧光显微镜下观察。

1.2.5 Nkx2.5、HCN4、缝隙连接 蛋白(Cx40)、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1 m RNA的表达 用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测m RNA水平,转病毒后48 h,用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA,按逆转录试剂盒说明书将提取的总RNA逆转录成c DNA,进行q-PCR检查。反应条件为:95℃预变性15 s,58℃退火20 s,72℃延伸45 s,共循环40次,以R-GAPDH作为内参,引物见表1。

表1 各引物名称、序列及产物长度

1.2.6 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1蛋白表达 采用蛋白质免疫印记(Western blotting)法测定,转病毒后48 h,提取细胞总蛋白。使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度,根据样品浓度确定上样量,在样本加入适量的5×蛋白上样缓冲液,沸水浴5 min,制备分离胶和浓缩胶,每孔约加40 ug蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白后,将蛋白转到PVDF膜上,移入适量抗体稀释液中4℃孵育过夜,TBST冲洗3次,使用HRP标记的二抗于室温下孵育30 min。暗室中曝光,显影、定影。AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。以GAPDH为内参作相对定量分析,实验重复6次。

1.2.7 HCN4蛋白表达检测 使用免疫荧光技术,将原代培养的NRVMs种于细爬片上,贴壁48 h后随机分为两组分别转染NC组和实验组腺病毒,72 h后于室温下使用PBS轻柔冲洗3遍,4%多聚甲醛固定15～20 min,PBS洗3遍,每次5 min。爬片稍干后,加用5%牛血清白蛋白(BSA)按1∶100稀释好的的大鼠HCN4单克隆抗体覆盖细胞,放于湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次,每次5 min,甩干后加入1∶50稀释的CY3标记的山羊抗大鼠的二抗室温孵育50 min,PBS清洗3次,每次5 min,加入50～100 ul的DAPI室温孵育5 min,滴加适量的抗荧光淬灭剂,盖玻片封片,荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理 采用SPSS17软件,对实验数据进行数据统计分析,计量资料采用±s表示,组间比较采用两独立样本t检验,以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 培养的细胞观察

刚分离的NRVMs圆形,未贴壁。24 h后可见贴壁的NRVMs,呈现菱形、三角形、边界清晰锐利,出现单个细胞自发搏动。48 h可见其与周围细胞形成连接,呈现成簇搏动,搏动频率(102±9)次/分(n＝6)。图1。

图1 48 h心肌细胞形态(×100)

2.2 心肌细胞纯度

视野中蓝色为DAPI染的细胞核,绿色荧光为NRVMs,选取6个不同视野估计纯度为0.91±0.01。图2。

图2 α-actin免疫荧光(×200)

2.3 确定病毒转染NRVMs的最适MOI

病毒转染细胞48 h后,荧光显微镜下观察,可见NC组和实验组存活心肌呈现不同程度的绿色荧光,由呈现的绿色荧光可估计转染效率。除MOI＝50对应NRVMs出现细胞状态差,大量死亡,其他MOI值对应的细胞生长状态尚可,可见随着MOI的增大,转染效率相应增加,其中MOI＝20对应的细胞呈现成片搏动,生长状态尚佳,转染效率约为90.84%±2.62%,依此确定最适MOI为20。图3。

图3 不同感染复数(MOI)转染NRVMs(×100)

2.4 基因Nkx2.5沉默效果评估

与NC组相比,实验组相对m RNA水平下调效率60%,Nkx2.5蛋白水平亦下调(P＜0.05,表2、3、图4)。

2.5 两组目的基因相对表达量及蛋白表达的比较

与NC组相比,实验组HCN4、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1表达水平升高,Cx40水平降低(P＜0.05,表2、3、图4、5)。

表1 不同MOI值下病毒转染效率/%

表2 两组目的基因相对表达量比较

表3 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1的蛋白表达

图4 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1的蛋白表达

3 讨论

RNA干扰是一种简单有效的可近似代替基因敲除的工具,作用机制是与靶基因同源的双链RNA被特异的核酸酶所降解产生小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),这些siRNA介导引起特异性降解目的基因的RNA,从而抑制并下调基因表达。本实验用腺病毒包裹合成的包含shRNA的质粒转染目的细胞,可直接高效率沉默目的基因,由于细胞转染病毒,对其状态和存活都有影响,由于干扰效率也受转染效果的影响,因此在保证转染效率的情况下,以NC组为参照衡量病毒对目的基因Nkx 2.5的沉默效果,以构建的病毒Ad-Nkx 2.5-sh RNA-GFP对NRVMs转染,经不断摸索,转染最佳MOI＝20,转染48 h m RNA水平和蛋白层面均证明了该病毒的沉默效果。

图5 两组HCN4蛋白的表达

Nkx2.5是心脏胚胎发育过程中重要的转录因子之一,已有研究显示Nkx2.5可抑制窦房结基因如Tbx3、Shox2和Isl1的表达,而Tbx3和Shox2可以抑制Nkx2.5的表达[4－7]。本实验在保证目的基因沉默效果后,用实时荧光PCR和蛋白质免疫印迹检测起搏细胞发育相关转录因子水平,结果显示这些转录因子水平整体上升,初步表明此时的NRVMs向起搏样细胞分化。

窦房结头部密集分布着起搏细胞,Wiese等[8]研究显示在鼠胚第14.5天,Nkx2.5在窦房结头部不表达,只在窦房结尾部有少量表达。窦房结头部的起搏细胞具有最高的自律性可产生起搏电流,起搏电流是起搏细胞舒张期自动除极化的重要决定因素,而HCN通道是起搏电流产生的重要分子基础,其中HCN4是窦房结中高度表达的亚型。Nkx2.5与HCN4的表达具有一定相关性,Mommersteeg等[5]研究表明胚胎发育过程中Nkx2.5抑制HCN4的表达。胚胎期肺静脉心肌和窦角心肌具有不同的表型,当肺静脉心肌Nkx2.5基因不表达时,可见其表型向窦角心肌转换,异位电活动增加,HCN4表达增加,而在工作心肌高度表达的Cx40表达减少。甚至有研究人员在分化的胚胎干细胞层面,通过siRNA沉默Nkx2.5的表达,发现HCN4水平增加[6]。本 实 验 在Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP转 染NRVMs 48 h采用实时荧光PCR和蛋白质免疫印迹检测细胞HCN4和Cx40水平,可见HCN4表达水平升高,Cx40表达水平降低,采用免疫荧光法检测显示HCN4通道蛋白的表达,结果显示实验组HCN4通道蛋白的表达明显强于NC组,表明此时的细胞具有起搏细胞表型,证实了沉默心肌细胞Nkx2.5,从而使之重编程为起搏样细胞的可能性。

本实验通过差速贴壁法分离NRVMs,由于心肌细胞是不可增殖分裂细胞,分离过程中不可避免混入成纤维细胞。成纤维细胞可增殖,在病毒干预之后,部分心肌细胞因病毒作用死亡,成纤维细胞可分裂增殖取代原有心肌细胞空间,进而可造成心肌纯度下降,在提取m RNA和蛋白时,可能影响实验结果,致使检测的变化不及应有的水平。