刘梦雅，袁 慧，高 洁，王永丽，尹晶晶，王新钢，刘 欢，李建国，秦秀军

(中国辐射防护研究院，药物毒理与放射损伤药物山西省重点实验室， 太原 030006)

目前，全球头颈部及原发中枢神经系统肿瘤人数逐年增多，放射治疗仍是其主要治疗手段，但放射治疗在损伤肿瘤细胞的同时，也会不可避免的损伤照射范围内正常组织，引起认知功能损伤[1]。认知功能障碍可表现为学习、记忆、思维、信息加工处理、推理、判断、语言表达等方面异常，严重影响患者生活质量。电离辐射致认知功能损伤动物模型的建立可以对其发病机制、辐射防护剂的研制等的研究提供研究基础。认知功能损伤模型的建立方法很多，包括化学物质损伤、物理损伤、转基因鼠模型以及老化鼠模型等[2]，本次研究主要根据本实验室照射条件，在不同剂量照射后通过一系列指标对模型建立进行评估，以此来判断模型建立的条件，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，5～6周龄，20只，体重140～170 g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号[SCXK(军) 2012 -0004]，合格证号：0035516；动物饲养管理于中国辐射防护研究院GLP 中心屏障环境中，使用许可证号[SYXK(晋) 2013-0002]，按照中国辐射防护研究院GLP 中心实验规范进行实验操作。动物经6 d检疫后，按照体重随机分为对照组(Control，C group)、10 Gy照射组(10 Gy IR group)、20 Gy照射组(20 Gy IR group)、30 Gy照射组(30 Gy IR group)，每组5只动物。本实验经中国辐射防护研究院实验动物伦理委员会批准[IACUC201603-02]。在整个实验的过程中，参与实验者以“3R原则”作为指导原则，并给予实验动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

GSH、MDA、8-OHdG检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；Elekta Synergy型直线加速器：英国Elekta有限公司；Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所； SN25776型酶标仪：美国Biotek公司；Histocentre 3型石蜡包埋机：英国Shandon公司；Finesse 325型石蜡切片机：英国Shandon公司；Excelsior全自动组织脱水机：英国Shandon公司；BX53型荧光显微成像系统：日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 照射条件及方法

将已麻醉的 SD 大鼠固定于泡沫板上，用X射线模拟机进行定位，照射部位为头部，身体其他部分用低熔点铅模具遮蔽，于山西大医院放疗科给予剂量率为3 Gy/min的6 MeV电子线照射，大鼠背部面向放射源，源皮距1.0 m，分别按照10 Gy、20 Gy、30 Gy的照射剂量进行单次照射，照射完成后送回动物，并于中国辐射防护研究院GLP 中心动物房统一饲养管理。

1.3.2 大鼠发病情况观察

在实验的过程中，观察记录大鼠的发病情况及生存期。

1.3.3 Morris水迷宫试验[3]

照射后一个月进行Morris水迷宫试验(Morris water maze, MWM)，Morris水迷宫由黑色内壁圆柱形水池和一个位置可移动和高度可调节的塑料站台组成。直径100 cm，高50 cm，池内水深30 cm，加热器将水加热在(21±2)℃左右。水池标有东、南、西、北四个入水点，并将水池分为东北(NE)、东南(SE)、西北(NW)、西南(SW)四个象限，在SE象限正中距池边缘20 cm处放一逃避平台，平台高29 cm,直径为10 cm，此平台表面有凸起便于动物站立，池中水没过平台1 cm左右，水池内池壁有各种图案为动物提供空间参照线索，便于大鼠定位平台，水迷宫上方放置摄像机，计算机内安装软件对大鼠游泳轨迹进行跟踪记录，完成后对数据进行统计分析。(1)定位航行实验(place navigation test)，在正式实验开始前一天将大鼠放入未放置平台的水池中自由游泳2 min，熟悉实验环境。定位航行实验周期为5 d，每天训练1个时段，每个时段训练4次，分别从4个象限的4个入水点入水，训练前将平台放在SE象限中，将大鼠面向池壁从入水点放入池中，对大鼠的游泳轨迹进行跟踪记录，并记录其从入水到爬到平台(四肢均在平台上)的时间，此时间即为逃避潜伏期(escape latency，LT)。让大鼠在平台上休息数秒后放回笼中。如果大鼠在2 min内未找到平台，则由实验人员将其引至平台，其逃避潜伏期记为120 s。每一时间段内4次逃避潜伏期的算数均数作为这一时间段的成绩，并进行统计。(2)空间搜索实验(spatial probe test)在定位航行实验后进行，即第6天撤去平台，任选一个入水点将大鼠放入池中，记录1 min内大鼠的游泳轨迹并进行分析。观察分析其穿过原平台所在位置的次数，记录大鼠在原平台象限停留时间、平台象限游泳距离及穿越平台次数，以检测大鼠的空间记忆能力。

1.3.4 氧化应激损伤相关指标检测

各组大鼠在照射30 d后处死取出脑组织，称取200 mg，放入洁净的匀浆管中，加入预冷的0.9%的生理盐水，将组织放在冰上剪碎、匀浆，2500 r/min离心10 min，收集上清液分装，-20℃中保存备用。分别严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书检测MDA、GSH和8-OHdG含量。

1.3.5 病理切片制作方法及HE染色

(1)制片：修取大脑，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及HE染色。(2)脱水及包埋：取组织，经自来水冲洗固定液，酒精梯度脱水后(70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ)，对组织进行透明(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ)，浸蜡(石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ)后包埋。(3)切片：包埋后的组织3～5 μm切片，经60℃烤片后染色。(4)染色：HE染色(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡、过100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、80%、70%的梯度酒精，苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色、过70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精)。(5)透明及封片：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后树胶封片，待镜检。之后对每组大鼠的大脑切片进行光镜检查、拍照。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠照射后一般状态观察

图1 不同剂量照射后大鼠生存曲线Figure 1 Survival curves of the rats after irradiation at different doses

照射后观察动物的一般状态，发现在照后第2天30 Gy IR组有动物发生背毛不整齐，流涎等症状，照后第3天死亡。如图1各组别生存曲线可以看出照后30天时，C组未见动物死亡，10 Gy IR组和20 Gy IR组动物死亡率为20%，30 Gy IR组动物死亡率为40%。由于单纯照射大鼠头部，故在照后各剂量组大鼠头颈部出现不同程度的脱毛现象，结果如图2所示，从图中可以看出30 Gy IR组大鼠头颈部出现严重的脱毛现象。

2.2 不同剂量照射后Morris水迷宫试验结果

5 d的定位航行实验结果如表1，从表中可以看出，时间因素(day)有统计学意义(P<0.05)，说明逃避潜伏期有随时间变化的趋势；但时间和分组的交互作用没有统计学意义(P>0.05)，说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同。个体间变异部分的计算结果显示，分组的P值小于0.05，说明分组因素起作用，各组潜伏期指标总体而言不同。30 Gy IR组在1～5 d的训练期中，潜伏期时间均高于其余三组且差异具有统计学意义(P<0.05)。

第6天空间搜索实验结果如表2所示，30 Gy IR组较C组原平台象限停留时间显著缩短(P<0.05)；穿越平台次数显著减少(P<0.05)；10 Gy IR组、20 Gy IR组、30 Gy IR组原平台象限游泳距离较C组均显著缩短(P<0.05)，且随着剂量的增加，原平台象限游泳距离逐渐缩短。

2.3 不同剂量照射对脑组织中内源性抗氧化剂和氧化损伤的影响

从表3中可以看出，四组间的GSH、8-OHdG、MDA差异均具有统计学意义(F=3.718、2.918、2.617，P<0.05)，进一步进行两两比较，与C组相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR组大鼠脑组织中GSH浓度降低，且30 Gy IR组与C组差异有统计学意义(P<0.05)。与C组相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR组8-OHdG、MDA浓度均升高，其中20 Gy IR和30 Gy IR组与C组MDA浓度差异有统计学意义(P<0.05)，30 Gy IR组与C组8-OHdG浓度差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 不同剂量照射后大鼠头颈部出现脱毛现象Figure 2 Hair loss occurred at the head and neck of rats after irradiation at different doses

分组Groups不同时间逃避潜伏期(s)Escape latency at different times第1天 Day1第2天Day2第3天Day3第4天Day4第5天Day5Control group61.79±31.8330.17±13.8712.07±4.7310.22±3.536.35±1.4810 Gy IR group76.42±23.7327.05±10.2311.69±6.7416.50±11.449.36±6.2520 Gy IR group81.12±29.4415.18±9.356.11±1.699.25±3.888.06±6.3630 Gy IR group95.51±23.4165.52±31.60*32.73±23.50*29.52±8.68*20.80±9.16*

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表2 不同照射剂量组大鼠Morris水迷宫空间探索实验结果比较Table 2 Comparison of results of spatial exploration in the Morris water maze in rats with different doses of irradiation

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表3 不同照射剂量组大鼠GSH、SOD、MDA、8-OhdG浓度比较Table 3 Comparison of GSH, MDA, and 8-OhdG concentrations in the rats irradiated at different doses of irradiation

注：与C组比较,aP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05.

注：A：正常细胞形态；B：10 Gy IR组细胞形态；C：20 Gy IR组细胞形态D：30 Gy IR组细胞形态；图中实线箭头所指为凋亡小体，虚线箭头所指为空染区。图3 不同照射剂量组大鼠大脑病理组织学改变(HE，×200)Note. A shows normal cell morpholo Gy; B shows 10 Gy IR group cell morphology; C shows 20 Gy IR group cell morphology; D shows 30 Gy IR group cell morphology; the solid arrows in the figure refer to apoptotic bodies, and the dotted arrow indicates empty stained area.Figure 3 Histopathological changes in the brain tissues of rats after different doses of irradiation(HE staining)

2.4 不同剂量组照射后大鼠大脑海马CA3区的病理改变

HE染色光学显微镜下观察显示：C组海马CA3区神经细胞基本观察不到凋亡、坏死等病理改变，细胞形态正常，细胞连接紧密，且排列整齐。照射后大部分椎体层细胞胞浆皱缩、深染，细胞数量减少，层次紊乱，排列无序，稀疏、松散，细胞连接不紧密。10 Gy IR组(B)个别椎体层内细胞可见凋亡小体，少量神经细胞坏死、结构消失。20 Gy IR组(C)和30 Gy IR组(D)组织结构破坏较10 Gy IR组更加严重，出现组织细胞凋亡、坏死等显著的病理改变。且30 Gy IR组(D)出现空染区，可见多个凋亡小体。

3 讨论

近年来，随着医学肿瘤治疗技术的快速发展，适形放疗、伽玛刀、X-刀等放射治疗手段的应用延长了患者生存期，但与此同时，对周围正常细胞的照射会引起正常组织不可逆损伤，进而引起头颈部肿瘤患者认知功能障碍的发生[4]，降低了患者的生存质量。有研究表明海马在人体大脑内主要负责学习记忆功能，电离辐射可以通过损伤海马的神经元细胞使人海马依赖性的学习记忆等认知功能受损[5-6]。而进一步研究显示海马区神经再生障碍目前被认为是辐射致认知功能损伤的主要原因[7]，但机制尚不明确。电离辐射致认知功能损伤动物模型的成功建立是进一步研究损伤机制、预防治疗手段的重要基础。

水迷宫实验是空间学习记忆相关研究的经典实验，可以评价动物的空间记忆能力，以此来判断认知功能相关脑功能区是否受到损伤，Rola等[7]利用5 Gy X射线对21日龄雄性小鼠进行全颅照射后发现，照后1个月和3个月，水迷宫测试空间记忆能力明显减退，表明幼年小鼠大脑经照射后会对认知功能造成远期伤害。另外，电离辐射对机体的损伤主要通过间接作用，即作用于机体大分子，使其发生电离，产生活性氧(ROS)，当ROS产生量大于机体可承受抗氧化能力后，会使机体产生氧化应激损伤[8]，因此与氧化应激相关的产物及内源性抗氧化物的浓度变化可间接反映大脑经照射后受损伤程度。电离辐射作用于机体的同时，机体组织形态结构也会发生变化，不同部位会发生相应的组织病理损伤[9]，故病理组织切片的观察也是判断损伤的重要指标之一。本次研究对大鼠脑部进行不同剂量照射后，通过检测以上指标，对建立的电离辐射致认知功能损伤动物模型进行评估，选择合适的照射剂量建立实验动物模型。

在本次实验中，选择三个剂量进行模型建立，通过观察动物照射后的一般状态、死亡率，空间记忆能力、病理组织切片和氧化应激指标的检测、发现单次30 Gy照射成功引起了大鼠空间记忆能力的受损。氧化应激损伤相关指标检测结果说明30 Gy使机体内内源性抗氧化剂减少，氧化损伤产物增多，对机体造成了氧化损伤。HE染色切片发现20 Gy IR组和30 Gy IR组组织结构破坏严重，出现组织细胞凋亡、坏死等显著的病理改变，从组织病理学角度观察到高剂量照射对组织的损伤，较为全面地验证了本次试验建立的动物模型。在临床治疗的过程中，为了减轻患者放疗产生的并发症，采用分割根治性化疗，但由于实验条件所限，本次实验采用的是单次大剂量照射；另外在照射的过程中为了方便动物的固定与定位，将动物麻醉，这样不能排除麻醉剂对实验的影响，今后实验人员在实验研究的过程中会尽量模拟实际临床治疗条件，进一步设计动物的固定方式，避免麻醉剂对实验的影响。

综合以上各指标的检测结果提示在本实验室的条件下，对头部进行30 Gy单次照射可以引起大鼠认知功能障碍，冀胜军等[5,10]通过不同剂量的电子线对SD大鼠进行单次全颅照射发现，2 Gy和10 Gy全颅照射不足以引起大鼠在短时间内发生急性认知功能障碍，30 Gy可以成功诱导大鼠发生急性认知功能障碍，与本次研究结果一致，与其不同的是本次实验增加了20 Gy IR组，检测到部分指标提示有放射性损伤，且本次实验指标检测均在照射后30 天检测。本次电离辐射致认知功能损伤动物模型的成功建立为下一步的机制研究、辐射防护剂的研究提供了动物模型、奠定了良好的实验基础。