刘 宁，史永锋，关一诺，赵 青，吴 迪，武军铎，高大松，刘 斌*

(1.吉林大学第二医院 心血管内科,吉林 长春130041；2.长春恒晨生物科技有限公司)

心力衰竭(heart failure ，HF)是一种心脏疾病的终末期临床综合征，可由多种心脏疾病引发。在我国，心力衰竭发病率为0.9%，患病率随着年龄增加显著上升[1]。心力衰竭患者的表现及病症大多类似，但是病因往往各不相同，且大多数患者很难查到确切的病因。因此给疾病的治疗带来了很大的困难，找到一种特殊的靶向物质，针对靶向物质检测心力衰竭是迫切需要的。

脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)也称中性内肽酶，是一种膜结合的金属内肽酶[2]。上世纪90年代，研究人员合成NEP抑制剂并与血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)联合使用治疗心力衰竭取得了一定进展[3]。近些年来，脑啡肽酶作为心力衰竭诊断的新靶点受到了极大的关注[4]。目前，已有相关报道证实NEP可以作为HF患者的病理生物标志物。本研究旨在研究脑啡肽稳定性是否适合作为心力衰竭生物学标志，以及研究其在血清中含量与活性的关系。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

采用脑啡肽酶检测试剂盒(酶联免疫吸附法)(长春恒晓生物科技有限责任公司)测定血液样本中的脑啡肽酶含量；采用脑啡肽酶活性检测试剂盒测定血液样本中脑啡肽酶活性。测试所用仪器为赛默飞世尔酶标仪Varioskan LUX， 美国。

1.2 研究方法

1.2.1标本采集

抽取心力衰竭患者空腹血液2 ml，于非抗凝管中。采集后的血液4℃保存，并在4 h内3 000 rpm离心10分钟，缓慢吸出上层血清，转入EP管中。

1.2.2检测方法

(1)血清中NEP稳定性研究：将30个心力衰竭患者的血清放入一个50 ml离心管中，涡旋混匀后分装，每管200 μl。将获得的多管混合血清分组，分别放入-80℃、-20℃和4℃中保存。以-80℃中的样本作为对照组，测定4℃保存8 h、12 h、16 h和24 h的样本中NEP含量。同样，以-80℃中的样本作为对照组，测定-20℃保存7 d、14 d、21 d和28 d的样本中NEP含量。

(2)血清中NEP含量及酶活性相关性研究：分别用NEP含量检测试剂盒和NEP酶活性检测试剂盒测试40例患者血清中的NEP。通过相关性分析比对，血清中NEP含量及活性关系。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析处理。计量资料以均数±标准差(x—±s)表示，各组数据间采用t检验；P<0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中NEP的稳定性研究

研究结果表明(表1)，分离后的血清在4℃中保存24 h之内，其性质稳定，未见显著下降(P>0.05)。-20℃保存的血清其保存稳定时间较长，通过实验结果可见(表2)，-20℃保存的血清28 d后其含量下降并不显著(P>0.05)。

表1 4℃保存血清中NEP稳定性(pg/ml)

表2 -20℃保存血清中NEP稳定性(pg/ml)

2.2 血清中NEP含量及酶活性关系的研究

采用NEP浓度测量和酶活性测量试剂盒对同一批患者血清进行检测，检测结果进行相关性分析(图1)，可已看出血清中NEP含量与酶活性成正相关，相关系数R2为0.7017，二者相关性较强。

图1 血清中NEP浓度与酶活性相关性

3 讨论

NEP作为膜结合蛋白，与 其他类似蛋白有着相同的性质，即可以从细胞膜表面释放，产生保持催化活性的非膜相关形式[5]。早在30年前，科研人员就发现血清中的NEP活性与急性呼吸窘迫综合征和心源性肺水肿相关[6]。而最近才有研究提供证据，显示NEP在心力衰竭患者中可作为病理学生物标志替代物[7]。

有研究人员评估了1069个慢性心衰患者，患者中主要是射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)患者[5]，通过多因素复杂分析NT-proBNP与可溶性NEP与患者的住院及死亡风险有显著的相关性。直接比较NT-proBNP与可溶性NEP可以发现NEP在神经激素调节中的核心作用。此外，研究显示可溶性NEP受合并症影响较强，尤其是肾功能障碍和肥胖症的影响[8]。而在射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)患者中，可溶性NEP的表达量与预后并无显著相关性。一些研究人员还发现，BNP水平高的患者血液中可溶性NEP水平也较高，但是研究人员没有研究他们与预后的关系[9]。

以往的这些研究都预示着可溶性NEP可以作为一种诊断心力衰竭的新的生物学标记物。然而，目前各种检验NEP水平的实验都需要进一步的完善和验证。综合先前的研究，研究报告中可溶性NEP均保存在-80℃中，但是没有实验人员对可溶性NEP在血清中的稳定性进行研究。要作为可诊断的生物学标记物，需要有一定的稳定性，本研究发现从人血清中的NEP在4℃环境中可以保存24 h，在-20℃中可以保存28 d，其稳定性与-80℃中保存的样本其含量无显著差异(P>0.05)。这说明人血清中的可溶性NEP具有较好的稳定性，基本可以满足临床检测对样本储存和复检的需求。

另外，还有一点值得注意的是NEP是成熟中性粒细胞的表面标记[10]，因此适当离心和样本分离是防止不必要的膜结合NEP污染的关键。在适当离心之后，血清样本原则上是非细胞的，而血浆可能含有残留的细胞物质，会对结果分析造成混淆，因此本实验选择血清作为实验样本。

通过对之前研究总结发现，大多数研究人员选择研究NEP在血液中的浓度来研究其对心力衰竭患者的诊断作用。而NEP作为一种酶，其在心力衰竭发生发展过程中的作用主要体现在他的酶活性强弱方面。因此了解血液样本中NEP含量与NEP酶活性之间的关系，对其研究有一定指导性的意见。本研究通过对40例心衰患者血液样本同时检测NEP含量及活性，结果显示，在人血液样本中NEP含量及活性成正相关(r2=0.7017)，相关性较强。因此可以通过研究血液中NEP的含量来了间接显示其酶活性强弱。

综上所述，NEP在人血样本中较稳定，可以满足临床检测对样本储存及保留复检的要求。结合之前的研究结果，NEP有望成为心力衰竭诊断的生物学标记。只是检测方法还需要研究人员不断完善。