2岳广欣巫鑫辉

偏头痛是一种常见的、高度致残的原发性头痛，和较高的社会经济负担相关，并具有很高的患病率[1]，被世界卫生组织列为第六大致残疾病[2]。研究显示，每年有2.5%左右的头痛病人会发展为慢性偏头痛[3]，其中约38%的慢性偏头痛病人需要采用预防性治疗[4]。偏头痛虽然不能治愈，但大量的研究证实规范的预防治疗可以明显地降低偏头痛病人的发作频率，减轻发作程度，减少功能损害，提高生存质量，减轻病人的经济负担[5-6]。但有研究显示，目前偏头痛的治疗普遍不足，仅有约20%的人接受过预防性的治疗[7]，其中超过25%的偏头痛病人适合预防性治疗，然而可能从中获益的病人中有相当一部分没有得到过预防性治疗[3]。我国从古就重视预防治疗，如《黄帝内经·素问》：“上工治其萌芽……下工救其已成， 救其已败。”从社会现状和病情需要来看，采用中药治疗偏头痛有重要意义。本课题组前期研究了采用芎芷地龙汤1 d、3 d、7 d预防给药对偏头痛模型痛阈及血管活性物质的影响[8]，为深入探讨芎芷地龙汤对偏头痛的预防治疗机制，本实验拟观察芎芷地龙汤不同时间点预防给药后，三叉神经血管系统中三级神经元中CREB1a、CREB1b mRNA表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体动物(SPF级)成年雄性SD大鼠，体重(200±20)g，由维通利华实验动物技术有限公司生产。动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 药品与试剂 芎芷地龙汤(川芎、白芷、生石膏、地龙、元胡)由北京中医药大学东方医院制剂室提取，每毫升含生药2.0 g；硝酸甘油注射液(5 mg/mL)购于北京益民药业有限公司；琥珀酸舒马普坦片，每片25 mg，购于海南先声药业有限公司；异丙醇(无锡市化学试剂厂生产)；焦碳酸二乙酯(DEPC)，北京欣经科生物技术有限公司生产；三氯甲烷(氯仿)，由北京化工厂生产；TRIZOL Reagent(Invitrogen)；High Pure RNA Tissue Kit(Roche REF12033674001)；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem(Promega A6010)；Go TaqqPCR Master Mix(Promega A6002)。

1.3 实验仪器 电动手持匀浆器(KONTES)；PCR仪(Bio-RAD CFX96 Real-Time System)；三用电子恒温水箱(SHH.W21，北京中兴伟业器仪有限公司)；分光光度计(Nano Vue plus)；恒温震荡金属浴(Bioer，MB-102)；低温高速离心机(SIGMA 3K15)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 SD大鼠随机分为6组：生理盐水对照组、偏头痛模型组、舒马普坦组、芎芷地龙汤1 d预防给药组(1 d XZDLT组)、芎芷地龙汤3 d预防给药组(3 d XZDLT组)、芎芷地龙汤7 d预防给药组(7 d XZDLT组)。

1.4.2 造模及给药 生理盐水对照组：给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃7 d，普通饲养，末次灌胃30 min后颈背部皮下注射生理盐水2 mL/kg 。偏头痛模型组：给予生理盐水10 mL/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后颈背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg(5 mg/mL)。芎芷地龙汤组：其他处理同偏头痛模型组，给予芎芷地龙汤10.8 g/(kg·d)灌胃(1 d，3 d，7 d)，末次灌胃30 min后于颈背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg。舒马普坦组：其他处理同偏头痛模型组，给予琥珀酸舒马普坦6 mg/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后颈背部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油。

1.4.3 取材 在造模完成2 h后，采用腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)进行深度麻醉，快速断头，在超净台内冰上剪开颅骨取脑，剥离出硬脑膜、丘脑、三叉神经脊束核、三叉神经节，然后放入2 mL的无菌外旋冻存管中，于液氮中迅速冷冻，-70 ℃低温冰箱保存备用。

1.4.4 大鼠组织总RNA的提取和含量的测定

1.4.4.1 总RNA的提取 严格按照试剂盒(High Pure RNA Tissue Kit)的说明书进行操作，先将400 μL Trizol裂解细胞加入到装有标本组织的离心管中，然后按顺序加入适量的氯仿、异丙醇、75%的预冷乙醇、DEPC水，再分别进行纯化、沉淀、洗涤、溶解总RNA操作。用微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度。根据A260的值计算RNA浓度(单位：μg/μL)，然后根据A260/A280比值计算其纯度，要求比值为1.8～2.0，比值低于1.6者剔除。

1.4.4.2 逆转录反应(reverse transcription，RT)步骤 严格按照试剂盒的说明书进行操作，对于20 μL反应体系，操作步骤如下：取1.5 mL离心管配制模板，加入：RNA 11 μL，引物(Random Primer) 1 μL，加入总RNA量1.1 μg；置于震荡型恒温金属浴中，70 ℃、5 min，然后快速转至冰上至少1 min；离心使液体收集于管底，加入：5×Reaction buffer 4 μL，氯化镁25 mmol/L 2 μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mmol/L 1μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，GoScrpt RT 0.5 μL；RNA引物混合液12 μL与逆转录混合液8 μL充分混合，置于震荡型恒温金属浴中，震荡加热25 ℃、5 min，后放入三用恒温电子水箱，42 ℃、1 h，再置于震荡型恒温金属浴中，70 ℃、15 min，冷却；立即PCR反应，后放入-20 ℃冰箱保存。

1.4.4.3 PCR引物设计 根据Genebank的序列和文献参考，设计CREB1a、CREB1b、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下，CREB1a-上游：5′GAGGTGTAGTTTGACGCGGT 3′,CREB1a-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，扩增长度：243bp；CREB1b-上游：5′GCAGTGACTGAGGAGCTTGT 3′，CREB1b-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，扩增长度：169bp；GAPDH-上游：5′GTTACCAGGGCTGCCTTCTC 3′，GAPDH-下游：5′GATGGTGATGGGTTTCCCGT 3′，扩增长度：177 bp。

1.4.4.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time RT polymerase chain reaction，real-time PCR) 取出等量的RT反应产物，分别扩增CREB1a、CREB1b、GAPDH基因。5倍稀释RT反应产物cDNA：Nuclease-Free Water 40 μL，cDNA原液10 μL；real-time PCR体系：20 μL反应体系；cDNA稀释液：4 μL；primer F(20 pmol/μL)：0.5 μL；primer R(20 pmol/μL)：0.5 μL；Mix，10 μL，加Nuclease-Free Water至20 μL；轻轻混匀，2 000 r/min离心20 s后进行PCR扩增；在95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，15℃、30 s下扩增共40个循环。反应结束后，得到每个样品中相应目的基因的Ct值，然后减去GAPDH的Ct值，得出相对Ct值作为n值，再作1/2-n运算，得出每个样品中目的基因的相对表达量即 Quantity(目的基因/GAPDH)，校正后得到每个样品中目的基因CREB1a、CERB1b的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠三叉神经节、三叉神经脊束核、丘脑、硬脑膜的CREB1a mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠CREB1a mRNA在三叉神经节、三叉神经脊束核表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，在丘脑、硬脑膜表达水平降低，差异无统计学意义(P>0.05)。给药干预后，三叉神经节、三叉神经脊束核CREB1a mRNA表达水平均降低，其中以7 d XZDLT组和舒马普坦组降低明显(P<0.01)；给药干预后，丘脑、硬脑膜CREB1a mRNA表达水平有所变化，但其他各组与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

组别只数 三叉神经节三叉神经脊束核 丘脑 硬脑膜对照组61.121±0.0861.126±0.0541.051±0.0440.993±0.066模型组62.471±0.0591)2.148±0.0871)0.986±0.0740.926±0.0421 d XZDLT组61.863±0.1291)2)1.900±0.0701)2)1.118±0.0430.986±0.0583 d XZDLT组61.723±0.1171)2)1.328±0.0961)2)1.090±0.0650.841±0.0487 d XZDLT组61.373±0.0801)3)1.161±0.0413)1.056±0.0220.855±0.048舒马普坦组61.176±0.0803)1.003±0.0561)1.133±0.0400.861±0.048

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各组大鼠三叉神经节、三叉神经脊束核、丘脑、硬脑膜的CREB1b mRNA的表达 与对照组比较，模型组大鼠CREB1b mRNA在三叉神经节、三叉神经脊束核表达水平升高(P<0.05)；在丘脑、硬脑膜表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。给药干预后，CREB1b mRNA在三叉神经节、三叉神经脊束核表达水平升高，以7 d XZDLT组和舒马普坦组升高明显(P<0.01)；在丘脑、硬脑膜表达水平，各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

组别只数 三叉神经节三叉神经脊束核 丘脑 硬脑膜对照组6 1.208±0.0771.332±0.0332)1.015±0.0461.078±0.046模型组6 0.982±0.0451)0.993±0.0571)1.047±0.0481.013±0.0481 d XZDLT组6 1.258±0.0431.428±0.0311)2)1.105±0.0371.138±0.0373 d XZDLT组6 1.447±0.0791)1.525±0.0481)2)1.097±0.0651.082±0.0657 d XZDLT组6 1.525±0.1111)3)1.638±0.0431)3)1.155±0.0661.187±0.066舒马普坦组6 1.583±0.1431)3)1.753±0.0261)3)1.123±0.0641.185±0.065

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；3)P<0.01

3 讨 论

偏头痛的发病机制目前没有定论，以三叉神经血管学说为主流学说。三叉神经节发出假单极三叉神经初级纤维，其突触终止于颅内外结构(血管)以及脊髓三叉颈复合体。三叉颈复合体的二级神经元通过脊髓丘脑束上行，终止于丘脑皮层的三级神经元[9]。在大脑中，cAMP反应原件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在不同的区域表达，并调节多种功能，如细胞生长、增殖和记忆，以响应各种细胞内信号事件，包括突触功效和突触可塑性的长期变化[10]。有研究表明，CREB在三叉神经尾核中有大量表达，和其磷酸化产物pCREB是脊髓痛觉区域激活后表达的核蛋白。曲普坦减弱CREB在三叉神经系统中枢的活性，这导致对中枢敏化的潜在抑制[11]。和c-fos相似，CREB也参与了痛觉信号的处理，在脊髓水平，CREB在组织损伤诱发的炎症和痛觉过敏之后脊髓神经元产生的长时程易化中发挥作用[12]。在核转位之前抑制 CREB 可以阻止脑干内痛觉敏化的发生[13]。CREB在突触可塑性和疼痛的调节中具有重要作用，通常被用作躯体感觉神经通路疼痛相关可塑性变化的标志物，其在前脑内介导的转录过程的增强能提高对慢性炎症疼痛和神经性疼痛大鼠模型非毒性刺激的行为应答[14]。注射过CREB反义寡聚核苷酸的大鼠表现出程度更低的温度痛觉过敏，提示脊髓CREB蛋白水平的降低可以减少痛觉过敏的应答[15]。感觉神经细胞体内转录水平的变化，包括特异形式CREB蛋白活动水平的变化，对于突触的长时程易化(long-term facilitation，LTF)是至关重要的[16]。有研究发现，CREB1基因可能是CREB、CREM和ATF1家族基因中唯一在海兔神经元中表达的成员。CREB1a蛋白是在长时程易化过程中的充分必需激活因子，而CREB1b则对CREB1a和长时易化起抑制作用[17]。有研究显示，CREB1抗体能提升神经性疼痛大鼠缩爪阈值，同时降低c-fos的表达水平[18]。

本实验研究观察到，注射硝酸甘油后，CREB1a mRNA在三叉神经节和三叉神经脊束核表达水平明显升高，给药干预后在该部位表达水平明显降低，以芎芷地龙汤7 d预防给药组和舒马普坦组下降明显(P<0.01)。注射硝酸甘油后，CREB1b mRNA在三叉神经节和三叉神经脊束核表达水平明显降低，给药干预后在该部位表达水平明显升高，芎芷地龙汤7 d预防给药组和舒马普坦组升高明显(P<0.01)。而在硬脑膜和丘脑处，各组CREB1a mRNA和CREB1b mRNA的表达差异均无统计学意义(P>0.05)，这可能是因为硬脑膜无菌性炎症被普遍认为是偏头痛的关键发病环节[19]，以血管的扩张、血浆蛋白外渗、肥大细胞脱颗粒而使促炎性物质释放，从而进一步激活分布于其上的初级传入纤维，引起疼痛发生[20]。丘脑则被认为是处于伤害性信息的中央处理和整合的中心，被看作是处理传入感觉信息的中转中心，甚至能调节这些信息，并参与组成“痛感矩阵”，整合所有对疼痛的感受、情感和认知应答[9]，功能过于复杂。这也可能与CREB通过磷酸化发挥作用有关[21]，有研究证实，CREB磷酸化后可激活部分即早基因(如c-fos)的表达，激活对突触功能起重要作用的参与痛觉传导的物质如神经元型一氧化氮和脑源性神经营养因子[22]，同时也在神经病理性疼痛[23]和炎性疼痛[24]的病理过程中起着重要的作用，并在注射硝酸甘油或硝普钠后表达增加[25]。因此，CREB在偏头痛三叉神经血管通路中的作用还需进一步研究。

综上所述，预防使用芎芷地龙汤可以减少硝酸甘油诱发的三叉神经节、三叉神经脊束核CREB1a mRNA表达，增加三叉神经节、三叉神经脊束核CREB1b mRNA表达，其中以预防给药7 d组效果最好。