魏全侠，刘建宇

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150000)

周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)主要与创伤、肿瘤和医源性病变有关，可导致机体出现神经功能缺陷和功能障碍。据统计，发达国家每年约有PNI新发病例18/10万例，而发展中国家发病率相对更高[1-2]。

对于无间隙的神经不连续，一期缝合修复是首选的治疗方法。尽管有良好的无张力神经修复，但其最终功能恢复状况，如神经生长、神经支配区的感觉及运动恢复情况可能受到炎症、瘢痕形成以及感觉和运动轴突再生方向的限制，再生速度约1 mm/d[3]。对于有间隙的神经不连续，可以自体神经移植，但受到所获取神经的.可用性和供体部位发病率的限制。目前，通常不推荐将各种合成导管和脱细胞同种异体移植物用于间隙>3 cm的神经缺损的修复[4]。先进的生物工程可以重建神经细胞外基质，但缺乏关键的神经导管细胞成分，特别是对再生至关重要的施万细胞。施万细胞通过分泌各种神经营养因子，形成有利于轴突再生的微环境[5]。施万细胞与周围细胞外基质相互作用，使髓鞘稳定于正常状态，并在再生过程中转变为亲髓鞘表型[6]。神经损伤刺激神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子等多种神经营养因子，可促进轴突生长[7]。但在周围神经损伤修复过程中，短时间内无法获取足够的施万细胞，严重限制了其临床应用。干细胞作为类施万细胞的来源，可驻留在受损神经周围，并通过改善微环境以及分泌神经营养因子来提供稳定的促再生环境。现就与促周围神经再生相关的不同类型干细胞的特征及其促神经再生机制、细胞递送以及每种干细胞促外周神经再生策略的应用现状予以综述，以期促进周围神经损伤修复领域的发展。

1 干细胞来源

干细胞指可分化成特殊细胞类型，并具有自我更新能力的细胞[1]。根据发育阶段的不同，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞。全能干细胞可以形成包括胚外组织在内的整个胚胎，多能干细胞可形成中胚层、内胚层和外胚层。单能干细胞或祖细胞只能分化成一种特定的细胞类型，干细胞的分化潜能与其发育阶段有关，ESCs分化潜能高，而特定组织干细胞分化潜能较低，完全分化的体细胞无分化潜能。诱导多能干细胞(induced multiripotent stem cell，iPSC)是一种可以直接从成体细胞中产生的多能干细胞[3]。Thomson等[1]发现，体细胞可通过转录调控表达更多的胚胎表型。

1.1ESCs ESCs是胚胎发育囊胚期多能干细胞，可从中胚层、内胚层和外胚层分化成体细胞，并可应用于周围神经损伤的治疗。为了替代神经再生所需的施万细胞，Ziegler等[5]研发出一种由人类ESCs经诱导分化产生施万细胞的方案，其效率约为60%。在大鼠坐骨神经损伤模型中，Cui等[6]通过微注射中性诱导的ESCs显著改善了轴突再生；免疫染色显示，ESCs存活并分化为类施万细胞。另有研究发现，在神经损伤/修复时，将ESCs注射到目标肌肉中，可防止肌肉发生去神经化改变，并可促进受损神经恢复[7]。ESCs也可产生额外的干细胞系。ESCs可产生间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，并已用于临床前动物模型的研究[8]。ESCs具有形成畸胎瘤的潜在危险，获得ESCs的人类胚胎来源有限，且存在伦理问题。

1.2神经干细胞(neural stem cells，NSCs) NSCs能够分化成神经元或神经胶质细胞，并存在于大脑和脊髓正常组织的神经发生过程中。NSCs可从小鼠模型中分离，并可在体外增殖[9]。有研究报道，NSCs植入对急性和慢性PNI均有益处[10]。然而，NSCs也有其缺点和局限，动物模型显示，商业小鼠C17.2 NSCs的神经母细胞瘤的发生率高，限制了其临床应用[11]。NSCs存在于大脑的多个区域，但很难从大脑中获得。此外，特定神经细胞系的定向分化较困难，目前的方法仅在有限的情况下有效，还需大量的实验研究。

1.2.1MSCs MSCs最初被认为是一种不同于造血系的骨髓内多能成纤维细胞，还可由多种非骨髓来源(脂肪组织、外周血、羊水、脐带、肌腱和毛囊、牙髓和胎儿组织中)分离获得。MSCs具有分化潜能，并具有调节机体免疫功能等优点，易于分离，在组织再生方面具有重要的研究价值[12]。MSCs天生具有分化成所有中胚层谱系的能力，如脂肪、骨骼、肌肉和软骨等[12]。在适当的环境下，MSCs可以被诱导分化成非间充质谱系，如神经元、星形胶质细胞、类施万细胞等，以支持神经再生，促进周围神经损伤的修复[13]。

1.2.2胎儿来源的干细胞 胎儿组织是MSCs最原始的来源，受年龄、环境和疾病引起的遗传损伤较少[14]。此外，MSCs还可以从其他多种来源获得，羊水、羊膜和脐带等组织均富含MSCs。胎儿出生后，羊水、羊膜和脐带等组织一般均被遗弃，故胎儿来源的干细胞足够多，且不受伦理的束缚，可在非侵入性操作下大量获取，使其成为非常理想的用于修复受损周围神经的干细胞来源。将获得的细胞在培养基中培养，使其增殖并分化，可分化成神经表型，从而促进受损周围神经的再生修复[15]。但目前研究仍处于体外阶段，还需进一步的探索研究。

1.2.3皮肤来源前体干细胞(skin-derived precursor stem cells，SKP-SCs) SKP-SCs位于真皮，是体细胞多能细胞的有效来源。SKP-SCs除具有持久的增殖能力外，还可分化为多种细胞类型，包括黑素细胞、内分泌细胞、神经元和胶质细胞等[16]。在神经调节蛋白-1β中培养的SKP-SCs可与施万细胞表达相同的标记[17]。此外，未分化和分化的SKP-SCs均表现出神经再生加速作用。SKP-SCs治疗可显著增加平均轴突计数，减少髓鞘损伤百分比，促进受损神经的修复再生[18]。多项研究表明，SKP-SCs在脱髓鞘、挤压损伤以及急慢性横断损伤等方面均具有较好的疗效[17-19]。

1.2.4毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs) HFSCs起源于神经嵴，数量丰富，较易获取，具有多向分化能力，在培养过程中容易扩增，但不能长期保存。此外，HFSCs可以分化为多种细胞类型，如脂肪细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等。未分化的HFSCs可明显改善小鼠坐骨和胫骨神经挤压和横断损伤模型的功能[20]。向脱细胞异种移植物中添加HFSCs培养中提取的神经元和施万细胞，可显著改善大鼠4 cm坐骨神经缺损的预后[21]。但目前对HFSCs作用机制的研究仍停留在临床前试验阶段，其确切作用尚需临床试验的确定。

1.2.5牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs) DPSCs存在于牙髓组织中，可表现出MSCs的特征，在适当的培养条件下，还可诱导成包括神经细胞在内的多个谱系。已有研究表明，DPSCs可化学诱导三叉神经节轴突生长，还可分化成施万细胞或滋养施万细胞以支持背根神经节轴突的生长，并促进髓鞘修复[22-23]。DPSCs还可分泌多种促进周围神经再生的营养因子[24]。此外，与骨髓基质细胞相比，DPSCs具有更强的增殖能力和更大的克隆生成潜能，并拥有更多的干细胞/祖细胞群，由此可见，DPSCs具有强大的临床适用性。

1.2.6肌源干/祖细胞(myogenic stem/progenitor cells，MDSPCs) 来源于骨骼肌的MDSPCs是目前研究最多的干细胞种类，可持续自我更新，并具有多能分化的潜能。有研究报道，MDSPCs可以被诱导分化成施万细胞、神经血管再生所需的神经外膜/神经内膜细胞、血管内皮细胞以及周细胞等，可用于神经病变的修复[25]。周围神经损伤常伴有肌肉骨骼损伤，受损肌肉组织中的MDSPCs可分泌与肌肉组织神经再生相关的神经营养因子[26]。MDSPCs可促进周围神经再生和预防肌肉萎缩，但缺乏合适获取部位，且相关研究证据仍有待进一步完善。

1.3iPSCs 各型干细胞均存在自身局限性。人工诱导干细胞为克服胚胎干细胞的限制带来了希望。Takahashi等[3]利用转录因子成功诱导出小鼠和人成纤维细胞的多能性。目前，对多种疾病中iPSCs的作用机制的认识逐渐深入，并将iPSCs用于体外药物筛选和疾病的疗效评估[27]。除经诱导向体细胞分化的方法外，学者还建立了iPSCs沿神经谱系分化的方法[28]。iPSCs在分化过程中的效率低，且可变性较强。对中枢神经和周围神经损伤动物模型的研究发现，iPSCs具有促神经再生潜力[29]。iPSC已被用于诱导神经球的3-D培养，以维持神经或神经胶质细胞的形成，促进神经生长及发育[30]。将组织工程生物可吸收神经导管中的iPSCs植入PNI小鼠体内，观察48周发现，轴突再生和髓鞘化增强，但未形成畸胎瘤，表明iPSCs可应用于PNI的修复和治疗[31]。

iPSCs在伦理和免疫抑制方面优于ESCs，但临床应用中仍存在染色体畸变、致瘤性等问题。干细胞移植临床应用的理想来源应该具有个体化、免疫耐受性强、易获取、非致瘤性、便于整合于宿主神经组织以及高效替代等功能。

2 作用机制

干细胞移植对PNI的影响主要取决于其分化表型、增强神经营养作用以及促进髓鞘形成的能力。干细胞可在适当内环境下经诱导分化为用于周围神经损伤修复所需的细胞类型，如对于神经生长发育有重要作用的施万细胞。在神经生长发育过程中，神经营养因子的作用不容忽视，微环境中神经营养因子的水平直接影响着干细胞移植作用效果。此外，移植干细胞在适当条件下可有效促进神经髓鞘的形成并加速神经损伤的修复。对干细胞移植修复受损周围神经作用机制的研究，将极大地促进神经修复再生领域的发展。

2.1干细胞分化表型 干细胞的自我更新能力使大量目的细胞作用于损伤部位成为可能。干细胞迁移到受损神经组织后继续增殖，并在适当微环境下分化为必要的细胞类型[32]。约5%的骨髓基质细胞可在无特异性干预的情况下自发地转分化为施万细胞[33]。通过化学诱导、生物处理、基因转染或注射前与神经细胞共培养，可有效地促进体外干细胞向理想表型的预分化。MSCs诱导的代表性方案是接触或由生长因子转染生长因子β-巯基乙醇和全反式视黄酸，细胞因子毛喉素、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等，尤其是骨髓基质细胞可通过转染缺口的跨膜和细胞内区域来表达NSCs标志物，或在Noggin转染后分化为神经球细胞[34-36]。有实验表明，干细胞需在分化培养基中维持2周，且类施万细胞必须与背根神经节神经元共培养，以维持在近端神经元轴索上的稳定形态特征[37]。

通过预分化，施万细胞标志物可在治疗中增加并维持更长时间。分化干细胞移植后，可加速横断轴突再生，其恢复程度可与施万细胞移植后观察到的恢复程度相当，甚至更高[38]。另有研究报道，预分化可促进移植后的细胞死亡，可能由于移植后机体主要组织相容性复合体的抗原能力增强，或移植后的细胞增殖能力较低所致[39]。MSCs的致瘤性是其潜在的缺陷之一，C17.2神经干细胞移植大鼠坐骨神经损伤模型已显示出较高的致瘤率[10]。

2.2神经营养增强作用 除分化为细胞外，干细胞还可分泌具有生物活性的神经营养因子，并为神经细胞的存活和神经再生提供有利微环境[40]。除支持施万细胞分化、成熟和增殖外，干细胞还可表现出更好地增强神经营养的性能。脂肪干细胞可能以神经营养依赖的方式抑制胱天蛋白酶3活性，从而减轻背根神经节损失[41]。微环境中生长因子的水平也会影响移植干细胞的效果，神经损伤刺激神经生长因子中和抗体可以消除体外骨髓基质细胞对感觉和交感神经轴突生长的刺激作用，脑源性神经营养因子中和抗体可降低脂肪干细胞对神经再生的影响[42]。

2.3髓鞘化 髓鞘化也是决定PNI再生质量和功能恢复的重要因素，多种类型的体细胞干细胞在体外表现出类施万细胞的相关功能，并促进受损神经再髓鞘化[42]。通过合成大量髓鞘蛋白，如髓鞘碱性蛋白、P0和PMP22，对髓鞘结构和功能的恢复起关键作用。与施万细胞类似，分化成类施万细胞的干细胞在体内也具有支持再生神经髓鞘生成的能力[43]。向自体静脉导管注射骨髓基质细胞，通过增强髓鞘因子信使RNA的表达，显著增加了有髓轴突数量，改善了面神经功能恢复[38]。牙龈源性MSCs和诱导神经干细胞的移植可促进周围神经的修复/再生，可能是通过拮抗髓鞘形成负性调节转录因子(c-Jun)和转录激活因子(Krox 20/EGR2)的调控，促进施万细胞的再髓鞘化作用[44]。

3 干细胞递送

干细胞可以通过多种方式递送。悬浮在培养基中的干细胞，可直接微注射到神经末梢，但微注射可能对干细胞和精细的神经内结构造成创伤，导致细胞分布异常；还可将干细胞悬浮在纤维蛋白基质中，在修复位点周围注射基质[45]。在导管修复中，干细胞可注射在导管腔内或导管基质上。Tse等[46]通过表性分析利用喷墨打印法打印神经细胞，打印后立即检测发现，90%以上的胶质细胞存活。三维打印的目的是在支架内创建具有多种细胞类型的组织，用于模拟天然组织，提供所需的几何形状(如多通道、分叉和个性化结构)，允许定制神经导管，精确匹配患者的特定神经缺损。

静脉、动脉等天然导管中富含胶原、层粘连蛋白等细胞外基质蛋白，有助于细胞黏附和轴突导向。商业天然导管通常充满胶原和纤维蛋白等细胞外基质成分。人工导管主要由聚乙醇酸、丝素蛋白、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸酯、硅酮管等合成。近年来，生物和纳米纤维导管的发展迅速，但其在基于细胞治疗的周围神经损伤以及废物降解和降解速度等方面的应用仍面临诸多问题。天然材料可以无毒的方式降解，且降解速度较快；而部分合成聚合物在降解过程中会产生酸性物质，不利于微环境和细胞活性[47]。中空腔管由组织有序的多纤维海绵或秩序较差的胶原海绵组成，与中空腔管相比，基底膜内部结构更有利于轴突再生。进一步完善干细胞递送系统可改善细胞分布，提高其用于神经损伤修复的疗效。

4 小 结

周围神经再生是动态的过程。目前，干细胞移植仍处于临床前研究阶段，尚未应用于临床实践。干细胞移植过程中基因操作、细胞不稳定性和肿瘤发生、干细胞的归巢和迁移仍是重要的亟待解决的问题。干细胞移植的简单应用已初显成效，但与传统神经修复技术相比，其治疗效果仍较差，尚需要大量的临床前研究对不同类型干细胞的作用进行比较。此外，最佳的施万细胞分化方式、确切的潜在作用机制等仍不确定，故难以得出明确的结论。骨骼肌来源干细胞拥有理想种子细胞的所有优点，且其取材容易、增殖稳定、具有多向分化潜能。随着组织工程学的迅速发展，干细胞移植治疗周围神经损伤将有广阔的应用前景。