李 鑫，王 猛

(天津市胸科医院胸外科，天津 300350)

肺癌是起源于呼吸道上皮细胞的恶性肿瘤，根据美国癌症研究协会调查数据显示， 2017年全球预计新增癌症病例16.8万，癌症死亡60万例，其中肺癌死亡人数占全部癌症死亡总数的12%左右[1]。由于肺癌早期无特异性症状，患者在发现时已处于中晚期，影响疗效和预后[2]。为提高肺癌的早期诊断率，增加患者生存率，迫切需要探寻一种高敏感性、高特异性、低创伤性的肺癌诊断方法[3-4]。代谢组学又称代谢轮廓分析，通过对各种生物样品中小分子化合物(分子量<1 000)的代谢产物进行定量测量和定性分析，监测不同代谢物的水平及变化，全面了解不同生物系统复杂的生理和病理状态[5]。由于代谢标志物能够敏感地反映机体的不同生理病理状态，因此可通过分析肺癌患者与健康人的代谢轮廓得到肺癌特异性代谢产物，分析这些代谢产物在肺癌发生、发展过程中涉及的代谢通路有助于肺癌的早期诊断。虽然代谢组学已广泛应用于各种恶性肿瘤的代谢组特征研究[6-8]、生物标志物的挖掘以及诊断模型的建立[9]，但将研究结论应用于临床上肺癌的早期诊断还存在很多问题。现就代谢组学技术在肺癌早期诊断中的研究进展进行综述，为寻找肺癌早期生物标志物和进行病因研究提供依据。

1 代谢组学技术

基因组学是从分子生物学水平研究疾病状态下基因的排列、顺序、数量等变化找出与疾病可能相关的基因。蛋白质组学则是从蛋白质水平研究疾病状态下蛋白质水平、含量的变化，找出与正常生理状态下相比表达有差异的蛋白质，作为潜在的生物标志物应用于疾病的诊断、治疗和预后。与基因组学和蛋白质组学技术不同，代谢组学的研究对象是内源性代谢物质(中间或代谢终产物)，通过分析这些代谢物质在体液及组织内的变化规律，可以从生物整体分析基因表达，蛋白质调节等内外因素对机体状态的影响[10]，机体内任何生理、病理或其他因素的变化都会影响代谢物的浓度或使代谢流发生改变[11]，因此代谢组学技术能更真实地反映机体的实际情况。目前主要的技术包括核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术、液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术等。NMR是第一个用于全面测量生物样品中代谢物的分析平台。这种技术具有许多优势：①无损伤性；②可进行生理条件或模拟机体生理条件的体外实验；③与特定干预手段相结合，研究不同动态系统中机体的化学交换、运动等代谢产物的变化规律；④实验方法灵活，而且需要的样本量较小[12]，被认为是代谢物结构分析的金标准[13]。目前，基于NMR的代谢组学技术已成功应用于寻找各种癌症的生物标志物，包括前列腺癌、胃癌、肾癌、宫颈癌、口腔黏膜鳞状细胞癌和其他癌症[14-17]。另外，一些研究结果显示了NMR在不同癌症患病风险的预测[18-19]、早期诊断[20]和分期[17,21]等方面的应用。NMR的主要缺点是其化学位移有限，导出的图谱中可能出现数百种化合物的峰，这些峰在图谱中相互重叠、干扰，导致图谱解析困难，因此NMR相对于LC-MS敏感性相对较低[22]。基于LC-MS的代谢组学技术具有较高的敏感性和特异性，能够对代谢物进行定量分析，鉴别代谢物的化学分子结构。但LC-MS也具有局限性，并不是对所有的化合物都敏感。由于LC-MS技术没有商业化的图谱库可以对比查询，需要研究者建立图库或分析图谱。为解决这一问题，气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、LC-MS等高敏感性和高分辨率的分析技术也被广泛应用于不同肿瘤的代谢组学分析研究。

2 代谢组学技术与肺癌诊断

不同癌症患者的癌细胞和组织基因组存在某些差异。由于癌细胞的异质性，许多基因和蛋白质诊断标志物的敏感性和特异性都大大降低，这些基因和蛋白质的标志物可能在一些患者中能有效识别肿瘤，而在另一些患者中无效[23]。肿瘤的发生、发展过程涉及机体的多个系统，代谢组学通过定性和定量的分析肿瘤发生、发展过程中的所有代谢产物，多角度地寻找肺癌的标志物，识别未知代谢产物，可以全面地反映机体的状态[24]。虽然目前代谢组学在许多方面还不成熟，对肺癌发生发展的作用机制、代谢特征等认识不够全面，但随着研究目标的确定、研究方法的不断完善和更新，代谢组学在肺癌的早期诊断方面得到很大发展。

2.1 呼气代谢组学 挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)是常温下以蒸汽形式存在于空气中的一类有机物的总称[25]。血液中经肺代谢后排出的产物称为内源性VOCs，而人体暴露于环境中，直接吸入肺部后呼出的称为外源性VOCs[26]。内源性VOCs是人体内新陈代谢的产物，其浓度和成分的改变与人体的健康或疾病相关[27]。Pauling等[28]首次采用气相色谱仪对人体呼出气成分进行研究，并统计了200多种VOCs，发现其中一些VOCs与不同病理状态存在相关性。Phillips等[29]采集肺癌患者和健康人的呼出气样本进行检测，发现22种VOCs可以作为肺癌的生物标志物。O′Neill等[30]采集肺癌患者和健康人的呼气样本利用GC-MS进行检测，发现28种以烷烃和苯的衍生物为代表的VOCs作为肺癌疑似生物标志物。Corradi等[31]采用固相微萃取法对肺癌患者、吸烟者、不吸烟者及健康人呼出气进行采样，进行GC-MS分析发现与吸烟者和非吸烟者相比，非小细胞肺癌患者呼出的空气中戊烷、2-甲基戊烷、2,4-二甲基庚烷的含量更高；与肺癌组、不吸烟组及健康人组相比，吸烟者BTEX(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)浓度较高，这些差异可以用来鉴别各种肺部疾病的特征指纹。Deng等[32]和Phillips等[33]对肺癌患者的呼气用GC-MS技术进行分析发现与健康人相比，肺癌患者的呼气中还有己醛和庚醛。Gaspar等[34]应用固相微萃取气相色谱-飞行时间质谱技术对肺癌患者和健康人的呼气代谢物组成进行分析，发现C14～C24直链和支链烷烃与肺癌相关性较强，能较灵敏地将化疗肺癌患者与未治疗的肺癌患者和健康人区分开。Bajtarevic等[35]用固相微萃取法和质子转移反应质谱技术分析肺癌患者和健康人呼气中的VOCs，确定醇、醛、酮、烃为肺癌潜在的标志物。Fuchs等[36]用顶空固相微萃取在线衍生化GC-MS对肺癌患者、吸烟者和健康人呼出气中的C1～C10醛类有机物进行分析，发现戊醛、己醛、辛醛和壬醛在肺癌患者呼气中的浓度更高。胡燕婕[37]对肺癌患者、良性肿瘤患者和健康人呼气中的VOCs进行了系统分析，确定了29种特征性VOCs，以长链烷烃类及甲基化衍生物，醛、酮、醇等含氧有机物等为主。这些研究利用代谢组学技术对人体不同生理病理状态下VOCs的成分进行检测分析，得到了可用于肺癌早期鉴别诊断的可能代谢标志物，认可了VOCs在肺癌早期诊断方面的应用价值。但是由于缺乏统一的采样标准和样本储存方法等，目前尚无商业化产物应用于临床。

2.2 血液代谢组学 在代谢组学研究中，血液标本因其低成本、采集方便的独特优势而应用广泛。Hori等[38]用GC-MS技术对29例健康人、33例早期和晚期肺癌患者的血清样本进行代谢组学分析，发现23种代谢物的水平在肺癌组和健康组有显著差异，不同病理分型(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)和不同病程(早期、晚期)的肺癌患者血清中代谢物水平和浓度具有特征性的变化。牛艳洁等[39]采用GC-MS技术对肺癌患者和其他肺部感染患者的血清小分子代谢物质进行分析，发现了13种差异代谢物。Miyamots等[40]用气相色谱-飞行质谱技术分析了非小细胞肺癌和其他肺癌患者的血液样本，发现甘油、乙醇胺、麦芽糖、棕榈酸、谷氨酸和乳酸的浓度在非小细胞肺癌患者中明显升高，而色氨酸、组氨酸和赖氨酸的浓度明显降低。Chen等[41]运用液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术和GC-MS技术结合的方法对健康人和肺癌患者的血清进行分析发现，α-羟基异丁酸的含量在肺癌患者中升高，而硫酸普拉睾酮和2，3，4-三乙基丁酸的含量降低。Musharraf等[42]采用GC-MS技术对肺癌患者、慢性阻塞性肺疾病患者、健康吸烟者和健康不吸烟者的血浆进行分析发现，肺癌患者血浆中脂肪酸、葡萄糖和酸的水平较其他组均升高。田舍等[43]利用核磁共振氢谱检测肺癌和正常体健者血清中小分子代谢产物，发现肺癌患者血清丙氨酸、谷氨酸盐、丙三醇、苏氨酸以及异亮氨基酸可能成为原发性肺癌的诊断标志物。肿瘤在肺部的生长过程中摄取了血清中大量的能量，机体通过增加有氧氧化途径中“原材料”来保证其他器官的正常能量代谢，出现糖代谢增强和脂肪代谢的减弱，一些氨基酸代谢相关的酶的代谢状态也发生改变，导致氨基酸异常表达。上述研究通过不同的代谢组学方法发现了不同的潜在肺癌诊断标志物，通过对相应物质进行进一步的代谢通路研究，可对肺癌在早期做出诊断和治疗，延长患者的生存期。

2.3 组织代谢组学 由于不同个体之间差异较大，不同病理类型的肺癌对血液中代谢物浓度的影响也较大，与血液标本相比，组织标本受外界因素影响较小，组织代谢物代表的是不同组织和器官的总变化水平。随着生物科学技术的不断进步，利用代谢组学技术从组织样本中筛选肿瘤潜在生物标志物已经取得快速发展。Wu等[44]对肺癌组织和正常肺组织中的代谢产物采用LC-MS技术进行分析，发现279肽和90肽为可能的肺癌生物标志物，并最终验证了一个12肽的标志物。与正常组织相比，该标志物在肺癌组织中的丰度更高。Jordan等[45]对肺癌患者和健康人的肺组织进行分析发现，在肺癌组织中乳酸、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的浓度升高，葡萄糖、肌醇和乙酸的浓度下降。陈文学等[46]以肺癌患者不同部位(肿瘤边缘、肿瘤中心和肿瘤实质)的组织萃取液进行代谢组学分析，发现与邻近非侵入肺组织相比，肺癌组织中乳酸含量显著升高，而肌醇、谷氨酰胺和缬氨酸的含量显著下降。Rocha等[47]用NMR技术对鳞癌和腺癌患者的癌组织进行分析，发现牛磺酸、尿苷核苷酸水平在腺癌组织中显著升高，而肌酸、谷胱甘肽在鳞癌组织中显著升高，这些差异代谢物对腺癌和鳞癌的区分度可达94%。Mathé等[48]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术对肺癌患者与健康者的癌组织及癌旁组织样本进行代谢组学分析，发现肌酸核苷与N-乙酰神经氨酸的浓度在癌组织中显著增加，提示它们可用于肺癌的早期诊断和预后评判。组织作为临床上诊断肺癌的金标准，但由于获取较困难，不利于作为肺癌早期筛查手段进行推广，在后续的研究中可将其结果与其他样本代谢组学结果结合，互相验证，探索敏感性高、特异性强的肺癌早期诊断生物标志物。

2.4 尿液代谢组学 与其他标本相比，尿液标本具有获得便捷、无创的特点，更易被大众所接受。与血液标本相同，尿液也包含许多因为发生肺癌而改变的代谢信息，另外，尿液经过肾小球过滤后，可以使氨基酸、有机酸等成分得到浓缩，方便检测，是代谢组学分析中最典型的生物样本。牛艳洁等[39]用GC-MS技术对肺癌患者和其他肺部疾病患者的尿液小分子代谢物质进行代谢组学研究，确定了7种差异代谢物。许国旺等[49]对肺癌患者和健康人尿液中核苷酸含量进行研究发现，与健康人相比，肺癌患者尿液中13种核苷酸明显升高。王文昭等[50]对肺癌患者与健康者尿样中修饰核苷代谢轮廓谱采用二维液相色谱在线分析系统结合最小二乘判别分析法进行了分析，初步鉴定出具有显著变化的修饰核苷。An等[51]采用大气压光离子化、大气压化学离子化和电喷雾离子化3种电离方式的“组合式”分析方法结合多变量生物信息学数据处理方法，对肺癌患者与健康人的尿液进行代谢组学分析，鉴定出11个代谢物在肺癌患者尿液中浓度明显增高。Yang等[52]对肺癌患者与健康志愿者的尿液进行分析，在肺癌患者尿液中鉴定出11个以氨基酸及其代谢产物为主发生上调的代谢物结构。Carrola等[53]采用核磁共振氢谱技术对肺癌患者与健康者尿液中的小分子化合物进行了代谢组学分析，发现马尿酸盐和葫芦巴碱在肺癌患者尿液中含量显著降低，而肌酐、ɑ-羟基异丁酸、β-羟基异戊酸、N-乙酰谷氨酷胺的含量显著升高。

2.5 细胞代谢组学 由于血液和尿液等生物样本容易受饮食、环境、年龄和其他疾病等因素干扰，而以肿瘤细胞为研究对象，通过研究不同细胞代谢物的差异表达寻找潜在的生物标志物可以避免常规实验中其他因素的干扰。Filipiak等[54]用GC-MS技术对肺癌细胞株CALU-1(人肺癌细胞系)和空白组上空的空气成分进行分析，发现4种代谢物浓度在肺癌细胞株组升高，而部分醛类浓度降低，采集肺癌细胞株NCI-H2087和A549的培养液上方空气进行分析，发现醇和甲基化烷烃的浓度明显升高，而醛类和丁基酯的浓度有所下降，证明肺癌细胞在生长过程中可能会产生某些特定的挥发性有机物，同时也可能会消耗某些特定的挥发性有机物[55-56]。余欣尉等[57]用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术分别对肺癌细胞与正常细胞产生的极性代谢物和非极性代谢物进行了指纹图谱分析，并采用生物信息学分析方法对代谢组学数据进行多维的统计学分析，发现肿瘤细胞存在异常的蛋白质、脂肪酸和磷脂代谢，并确定了31种对分类有贡献的潜在小分子代谢标志物，证明通过研究细胞代谢物的差异表达寻找肺癌特征标志物是可行的、有前景的新手段，并可以与传统以患者血液、尿液和组织为样本的代谢组学研究相互佐证和补充，为研究肺癌的发病机制、预防和治疗提供新思路和新方法。

2.6 其他 除以上几种常见的生物样本外，其他生物样本也被学者采集进行研究。Wen等[58]采用LC-MS技术研究胆红素水平与吸烟者肺癌的关系，结果发现胆红素水平与男性吸烟者肺癌的发生率及病死率呈负相关，提示低水平的胆红素可以作为男性吸烟者发生肺癌的潜在预警标志物。Callejón-Leblic 等[59]收集肺癌患者与健康者的支气管肺泡灌洗液，采用GC-MS代谢组学技术分析结合生物信息学分析方法，建立偏最小二乘判别分析模型，经进一步的代谢通路分析发现左旋肉碱、胆碱、磷酸、甘油、腺嘌呤5种代谢物在肺癌患者中存在差异。

3 小 结

肺癌的发生、发展是一个渐进的过程，随着生物学技术的不断发展、肺癌基础研究的不断深入，更多的物质将被揭示出与肺癌的诊断、治疗和预后的关系，为肺癌的诊断与治疗提供新的研究思路和方向。代谢组学作为一门新兴的学科，在分子水平辅助诊断肺癌，未来作为新技术应用于肺癌的诊断具有一定的应用前景。代谢组学和其他组学相结合是目前多组学研究的趋势，在科学技术的推动下，通过整合代谢组学和其他组学(基因组学、转录组学、蛋白质组学等)的数据和资源，建立完善可靠的肺癌生物标志物数据库，有利于提升对肺癌系统生物学的认识，从而能够更全面和深刻地揭示肺癌生物调控网络的复杂性。